9种猪病病原体GeXP多重PCR检测方法的研究

【摘要】 猪圆环病毒二型、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、水疱性口炎病毒、猪水泡病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌以及猪胸膜肺炎放线杆菌等都是临床上较为常见的,传染性强、流行广泛,且危害极为严重的猪病病原体,极大的影响并制约着我国的生猪养殖行业的发展,也对社会公共卫生安全造成了巨大的隐患。这9种疫病常以混合感染的形式出现,临床症状十分复杂,目前的检测手段难以应对。GenomeLab TM GeXP遗传分析系统是一种新型的多基因表达定量分析平台,将GeXP的多重PCR扩增技术与毛细管电泳分析技术相结合,利用带有荧光标记的通用引物和特异性嵌合引物的联合扩增,使目的基因得到高效表达,该技术具有特异性强、灵敏度高、高通量及检测速度快等优点。本研究根据NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列,对保守区基因序列进行分析比对,并设计9对特异性引物,利用常规PCR的单引物单模板和单引物混合模板的双重验证方式,对以上引物进行特异性验证分析;同时利用高效的pMD19-T Simple克隆载体构建9种阳性克隆质粒,应用GeXP技术进行测序分析。结果显示,所设计的引物均具有良好的特异性和敏感性,阳性克隆质粒测序结果均与GenBank所中公布靶基因序列相符,同源性达到99.5%以上。将9对特异性引物其进行优化和修饰,设计出两组GeXP引物:一对加有cy5荧光标记的通用引物和9对特异性嵌合引物,并建立单重GeXP体系、初步构建多重GeXP体系、对多重体系的特异性引物Tm值及特异性引物的含量进行优化,并验证其特异性及灵敏度。结果显示,单重GeXP体系灵敏度可达102copies/μL,灵敏度与Lamp相当,是荧光定量PCR的1000多倍;多重GeXP体系优化结果显示,最优Tm值为58.5℃,最佳特异性引物含量为上下游各0.5μL,在该反应条件下体系对于目的片段的扩增更加的清晰、特异、更易于的判断,同时提高了该体系扩增的稳定性。对其他12种常见畜病病原体的进行特异性验证时,均未发现非特异性扩增,从而进一步证明该多重GeXP体系具有极高特异性;对27份临床样本进行检测,结果显示阳性率为40.7%,与实际的结果相符,证明了该多重GeXP体系具有高准确性及较强的临床实用价值。