猪蓝耳病流行病确诊方法

临床流行病学及病理学诊断，在生产的各个阶段，根据猪群中发现有繁殖障碍，当暴发急性PRRS时，妊娠母猪后期发生流产、死胎、弱胎，新生仔猪死亡率高，出现呼吸道症状，组织病理检查，发病仔猪的间质性肺炎具有特征性。由于母猪及肥育猪除非在继发感染其他病原体的情况下，否则，不表现肉眼可见的病理变化。而其他猪临床表现温和猪群整体生产情况不理想，就要考虑PRRS。即使临床症状不明显，或缺少临床症状也不表明猪群中无PRRS病毒。或参照荷兰制订的三项诊断指标，即死产至少20%以上，流产母猪至少为80%以上，断乳仔猪的死亡率至少为26%以上。取其中两项作为诊断依据，可做出初步诊断。

PRRS的诊断目前主要用病毒分离鉴定，借助血清学试验检测PRRS抗原及其抗体。由于细胞制备和PRRSV不同毒株对细胞的选择性生长及毒株间的抗原差异，使实际诊断工作复杂、目前已建立血清学方法用于检测猪血清中的PRRSV，抗原及其抗体：如免疫氧化物酶细胞单层测定(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、中和试验(NT)、免疫酶技术( ELISA,Dot-ELISA)等。

（一）病毒的分离与鉴定

目前多将猪原代肺泡巨噬细胞、CL2621细胞系和Marc145细胞用于该病毒培养的分离。

细胞培养法：病毒分离样品选择和采取的所有操作应为无菌规程进行。用免疫组化技术检查发现，病毒存在于病猪的肺泡巨噬细胞，细支气管上皮、肺泡上皮细胞，脾脏的红髓及边缘区的巨噬细胞内。①病毒分离的首选材料是肺、扁桃体、脾、淋巴结和血清，死产和流产胎儿的脾肺血清和胸水是适宜的检验材料，弱胎猪和有呼吸道症状的急性感染猪的检出率最高。②常用细胞培养法的细胞系：已知PRRS病毒能在猪肺泡巨噬细胞(PAM)、传代细胞CL2621和Marc145等细胞系生长。③病毒的分离取流产胎儿，新生仔猪的肺、脾、肝、肾、心、脑、扁桃体、支气管、淋巴结、胸腺和骨髓匀浆制成悬液，进行分离病毒。用含抗生素的维持液（含2%胎牛血清随MEM营养液）做1:10稀释，4500r/min离心30min，经0.45nm滤膜过滤，上清用MEM做1：30稀释，接种于猪肺泡巨噬细胞(PAM)或CL2621、MA104细胞单层，于35℃吸附24h，加含4%胎牛血清的MEM，培养7d，观察CPE。首次传代有时可能无CPE，需盲传2-3代。不同的毒株可能适应不同的细胞系，有些毒株仅能在PAM或仅能在CL2621细胞中生长，欧洲株在PAM_上的复制速度更快、效率更高，而CL2621更有利于北美毒株的分离。出现CPE并能被特异的抗血清中和的样品即为PRRS病毒。也可将分离到的病毒用免疫过氧化物酶单层细胞试验进行鉴定。大多数分离物都能适应PAM，尤其是用血清作为分离样品，但不同的毒株对不同细胞是有选择的。有的只能在一种细胞上生长，有的可在多种细胞上生长。以血清和肺组织分离成功率最高，木乃伊胎最低。可用于病毒鉴定的技术有单克隆抗体或多克隆抗体免疫荧光抗体技术和单层过氧化物酶试验，RT-PCR技术以及电镜技术。

（二）抗体检测技术

1．免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) IPMA是最早报道用于检测PRRSV抗体的方法，本方法由荷兰中央兽医研究所的Wensvoort于1991年率先建立的，是目前欧盟最常用的PRRS诊断方法，特异性和敏感性好，该方法能在感染后6天的猪血清中检测到抗体，其缺点是试验结果主要靠主观判断，不能自动显示，操作复杂，费用高，有时出现假阳性；因而不适用于大规模检测，在我国未广泛使用。

2．间接免疫荧光抗体试验(IFA) IFA试验首先在美国应用于PRRS的诊断，与IPMA相当，可在感染后2-3周检测出抗体，已经成为欧美各国官方认可的权威检测方法，IgG-IFA检测的是IgG，最早在感染后6天即可检测出血清抗体，比ILISA检出时间提前1-2天。

3．酶链免疫吸附试验(ELISA) 主要用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。具有敏感性、特异性高，抗原用量少，不需要特殊仪器，快速、经济，结果便于长期保存等优点，适于短期内大批量血清样品的检测，已有很多国家将本方法列为常规检测方法。