大肠杆菌F4（F5天然菌毛及表达蛋白鸡卵黄抗体的制备及初步应用）

仔猪黄痢、仔猪白痢是由产肠毒素性大肠杆菌引起的新生仔猪常见的传染病,主要表现为严重的腹泻、脱水,并导致大批仔猪死亡,严重影响仔猪的成活率。目前,对该病的防治主要采用大肠杆菌多价苗免疫和抗生素治疗,但防治效果均不理想。卵黄抗体作为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂在防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻中显示出明显的效果,为该病的防治开辟了新的途径。目前制备仔猪黄、白痢卵黄抗体多以天然菌毛为免疫原,然而,天然菌毛提取和纯化的产量不能满足大量制备卵黄抗体的需要。本研究旨在利用基因工程技术,构建表达菌毛蛋白的重组载体,并使其在大肠杆菌中高效表达,为仔猪黄、白痢卵黄抗体的免疫原的大量制备提供一种新的方法。实验分别提取了产肠毒素大肠杆菌F4、F5天然菌毛,构建并高效表达了具有良好免疫原性的F4、F5融合蛋白。以上述天然菌毛和表达蛋白作为免疫原对9月龄海兰蛋鸡进行免疫。将鸡分为A(F4菌毛)、B(F4蛋白)、C(F5菌毛)、D(F5蛋白)4组,每组9个笼,每笼3-4只。A组又分为A1、A2、A3 3组,每组3笼,按照0.25mg／只、0.5mg／只、0.75mg／只三个免疫剂量分别对A1、A2、A3组进行肌注免疫。首免2周后进行第二次加强免疫。将A1组的3个笼(A1-1、A1-2、A1-3)按照0.25mg／只、0.5mg／只、0.75mg／只三个免疫剂量分别进行免疫,A2、A3组的分组与免疫剂量和方法同A1组。二免后2周收集鸡蛋并提取卵黄抗体用试管凝集试验和ELISA检测特异性抗体效价,选择效价最高的1组进行第3次加强免疫,剂量为1.00mg／只。根据检测结果确定收蛋时机。B、C、D组的分组与免疫剂量和方法同A组。实验对氯仿法、盐酸水稀释法、辛酸-硫酸铵沉淀法和聚乙二醇沉淀法提取的卵黄抗体进行了效价比较,确定了大量制备仔猪黄、白痢卵黄抗体的提取方法,并根据《中国兽药典》要求对提取的卵黄抗体进行了相关检测。用提取的卵黄抗体对3日龄仔猪的小肠上皮细胞进行了吸附和吸附抑制试验。取新生仔猪6窝,分别灌服K88ab菌毛、K88ab蛋白、K99菌毛、K99蛋白、K88ab菌毛+K99菌毛、K88ab蛋白+K99蛋白六种卵黄抗体。每窝仔猪平均分成两组：一半灌服1：9稀释的卵黄液,另一半灌服粗提的卵黄抗体,每只每天灌服5m1,从仔猪出生时开始连灌三周,每周前三天灌服。ELISA和试管凝集试验检测结果显示,以天然菌毛和表达蛋白作为免疫原均可产生高效价的卵黄抗体。三免后第3周效价达到最高,ELISA效价最高可达1：10240,试管凝集效价可达1：5120,该卵黄抗体高水平效价可维持5周。安全性实验结果显示,该卵黄抗体达到《中国兽药典》对兽医生物制品的标准。特异性实验结果显示,该卵黄抗体可与其相应大肠杆菌发生特异性凝集,而与其它大肠杆菌则无凝集现象。体外试验结果显示,将该卵黄抗体和大肠杆菌(K88ab+、K99+)按1：1的体积比混合作用30min后,能够抑制大肠杆菌(K88ab+、K99+)对仔猪小肠上皮细胞的吸附,而未用卵黄抗体处理的大肠杆菌(K88ab+、K99+)可紧密的吸附于仔猪小肠上皮细胞表面。临床实验显示,灌服该卵黄抗体后仔猪精神状态良好。灌服抗K99蛋白1：9稀释卵黄液的仔猪只有少数发生轻微腹泻,出生后1-3周的腹泻率分别为2.86%、11.4%、0%,其余各灌服组均未发生腹泻,对照组的腹泻率分别为3.57%、10.71%、3.57%,灌服抗K99菌毛1：9稀释卵黄液和抗K99菌毛卵黄抗体组与对照组的平均体重差异显著,其他实验组与对照组的平均体重差异不显著。结果表明,以表达蛋白作为免疫原也可以制备出高效价的卵黄抗体。本实验所制备的卵黄抗体对仔猪黄、白痢具有较好的预防和治疗效果,可以进行临床应用。