猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

魏春华刘建奎杨小燕戴爱玲李晓华

福建龙岩学院生命科学学院

预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种高度接触性、急性传染病，可以感染多种家畜和野生动物，猪是PRV的天然宿主、贮存者和传播者。主要特征为新生仔猪的急性死亡和4周龄以上的仔猪表现神经症状，该病的传播速度快，仔猪死亡率高。现在已有40多个国家报道猪伪狂犬病的发生，邓仕伟等统计我国已达31个省、市（含香港特区和台湾地区）发生猪伪狂犬病，给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟。戴爱玲等应用IDEXX的PRV-gE抗体试剂盒，对2007年～2009年福建省龙岩市的规模化猪场进行PR野毒感染血清学调查。结果表明：2007年～2009年PRV野毒抗体样品阳性率分别为19.2%、17.2%、18.0%，猪场阳性率分别为54%、65%、64.6%，三年来的样品阳性率和猪场阳性率没有明显的变化。依然存在感染压力。经产母猪的木乃伊胎和死胎中经常可以检测到PRV野毒感染，可见对猪伪狂犬病的防疫工作不容忽视。

2010年5月，在福建省龙岩市某养殖场采集的发病仔猪病料中成功分离出了伪狂犬病病毒。并进行测序分析，同时与Genbank中的PRV参考毒株进行同源性比较，并对闽西地区PRV毒株的分子流行病学及毒株来源进行了初步探讨。

1材料与方法

1.1病料

无菌采集疑似猪伪狂犬病感染的猪脑和肺脏作为病毒分离的病料。

1.2主要试剂

PK-15（猪肾传代细胞）购自武汉大学保藏中心；PRV阳性血清购自中国兽药监察所；rTaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP（2.5mmol/L）、DNAMarker均购自宝生物公司；DMEM为GIBCO产品；胎牛血清购于杭州四季青生物有限公司。UniversalGenomicDNAExtractionKit，pMD18-T克隆载体试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.3病料的处理

将采集的脑和肺脏剪碎，按每克加5mL的比例加入含青霉素（1000U/mL）、链霉素（1000μg/mL）的灭菌PBS，用组织研磨器充分研磨后于-70℃、室温反复冻融3次，4000r/min离心10min，取上清液备用。

1.4家兔接种试验

取2只家兔颈部皮下接种病料滤液1mL/只，另设注射无菌pH7.2PBS缓冲液的2只为对照。隔离饲养，观察记录结果。

1.5病毒的分离培养

取处理过的病料滤液接种于处于对数生长期的PK-15细胞吸附1.5h，间隔0.5h轻摇1次，使滤液与细胞充分接触，吸附后用PBS轻洗2次，然后加入不含犊牛血清的DMEM维持液，于37℃50mL/LCO2培养箱中培养，每天观察细胞病变（CPE）。盲传3代未出现CPE且鉴定为阴性者废弃，阳性者继续传代，直至出现CPE，当CPE出现80%时收毒，-70℃反复冻融3次后，4500r/min离心20min，取上清-70℃保存备用。

1.6PCR鉴定

1.6.1DNA的提取

取细胞培养物的上清液，用UniversalGenomicDNAExtractionKit试剂盒提取病毒基因组DNA。

1.6.2引物设计

根据蔺芳建立的多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒，合成gE基因的一对特异性引物。上游引物：5'-gcccacgcacgaggactactacga-3'；下游引物：5'-ttaagcggggcgggacatcaacag-3'。扩增长度为298bp。

1.6.3PCR扩增

25μL反应体系：DNA模板2μL、10×PCR缓冲液2.5μL、2.5mmol/LdNTP1μL，25mmol/LP1和P2各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，用灭菌去离子水补至25μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7测序

用凝胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆入pMD18-T载体中，构建重组质粒，经PCR鉴定后，交由上海生工公司测序，将获得的基因序列与GenBank中标准株的序列进行比较分析。

2结果与分析

2.1家兔接种试验

家兔接种24h～36h后开始发病，产生典型的伪狂犬病症状。体温上升达40℃以上，食欲减退或废绝，狂躁不安，频频舔咬注射部位及其周围皮肤，致使皮肤脱毛溃烂、出血，48h后四肢麻痹，卧地不起，最后衰竭死亡。对照组2只家兔无异常。

2.2病毒的分离

培养将病料上清液接种于已铺满80%的单层PK-15细胞，盲传3代后开始出现典型且规律的细胞病变（CPE），CPE表现圆缩、集聚、脱落继而死亡（见图1A），而空白对照组细胞形态正常（见图1B）。

2.3PCR扩增

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察可见298bp附近扩增出一特异条带，大小与预期结果相符。

2.4序列分析

2.4.1gE基因序列分析

对分离株gE基因的部分片段进行测序，并与GenBank上登录的山东分离株LA（AY173125S2）、河南分离株Min-A（AY170318）、湖北分离株Ea（AF171937），广州分离株Fa（AF403049），美国分离株Becker（AY368490），广东分离株Guangdong（AF403050）进行同源性比较。结果表明，核苷酸同源性介于95.5%～99%；推测的氨基酸同源性介于91.8%～98%。其中，分离株与河南Min-A株、山东La株的核苷酸的同源性与氨基酸序列的同源最高，分别为99%和96.9%。

2.4.2PRV毒株的遗传学关系分析

为了进一步了解PRV分离株的遗传学特性及相互的亲缘关系，在分析参考毒株基因组序列同源性的基础上绘制了系统发生进化树。通过核苷酸序列系统发生进化树分析的结果表明，分离株与Ea、LA的亲缘关系较近，而且与其余各参考株差异较大。氨基酸序列系统发生进化树分析的结果表明，分离株与Ea氨基酸序列亲缘关系最近，提示该分离株可能来自湖北。

3讨论

伪狂犬病可引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，尤其以产死胎较为严重。新生仔猪15日龄内死亡率100%，猪既是病原的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和带毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用。因此，该病的控制与净化关系到猪群其他疫病的发生与防控，关系到规模化场的经济效益。据报道，2006年我国猪“无名高热”也与伪狂犬病紧密相关。随着我国养猪业集约化规模化的发展，猪伪狂犬病在不少地区暴发流行，有逐渐扩大和蔓延的趋势。

本试验从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株伪狂犬病病毒。同时通过对PRV流行毒株的部分gE基因序列分析比较，通过遗传进化分析，发现流行株的变异情况，有利于在分子水平上揭示在规模化猪场仍然存在和发生伪狂犬病的原因，从而为实施科学有效的防治措施提供依据。为此，笔者采用PCR方法对分离株gE基因的部分序列进行扩增和测序，将测得的序列结果与山东分离株LA（AY173125S2）、河南分离株Min-A株（AY170318）、湖北分离株Ea株（AF171937）、广州分离株Fa株（AF403049）、美国分离株Becker株（AY368490）和广东分离株Guangdong（AF403050）进行同源性比较分析。结果表明，分离株与河南Min-A株、山东LA株的核苷酸的同源性与氨基酸序列的同源性最高，分别为99%和96.9%。通过系统发生进化树分析表明，分离株与Ea株的核苷酸与氨基酸亲缘关系最近，表明该分离株可能来自湖北，这可能与地域性农产品经济贸易往来密切有关。因此，规模化养猪场为根除伪狂犬病病毒要严格措施，比如引进种猪必须来自非疫区，引入的种猪必须隔离饲养30d以上，经检测合格后方可混群，要定期进行血清学检测等等。