高致病性猪蓝耳病（猪瘟和沙门氏菌混合感染的诊断）

高致病性猪蓝耳病、猪瘟和沙门氏菌混合感染的诊断

汪德生1，2，王文亮2，史开志2

1.贵州大学动物疫病研究所；2.贵州大学动物科学学院

蓝耳病是猪殖繁与呼吸综合征（PRRS）的俗称，病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。近年来，国内广泛流行由变异PRRSV毒株引起的高致病性蓝耳病，发病和死亡率均比较高，严重威胁养猪业的健康发展。由于PRRSV以具有重要免疫功能的肺泡巨噬细胞为靶细胞，破坏宿主免疫功能，造成带毒猪免疫抑制，从而易混合或继发感染其他疫病。2008年初，贵州省某养猪场出现仔猪群大批发病死亡，病猪表现高热、呼吸困难、皮肤微循环障碍，部分猪还出现一定程度腹泻。经流行病学调查、病猪剖检病变观察和实验室诊断，确定该猪群为变异毒株引起的高致病性蓝耳病，同时混合感染猪瘟和沙门氏菌。

1流行病学调查

2008年初，贵州省某养猪场发病时共存栏861头，其中，生产母猪240头，后备母猪96头，种公猪15头，断奶仔猪150头，哺乳仔猪360头。品种为大白、长白及其二元杂交后代。生产母猪和种公猪群在每年春秋二季（约4月和10月份）普遍接种口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬病疫苗。本次发病猪全为哺乳仔猪和断奶仔猪，部分发病猪曾在哺乳期间接种猪瘟脾淋苗。截止调查时，哺乳和断奶仔猪群发病率达70%左右，死亡率约40%，病猪临床表现为厌食，高热，体温达40.5℃以上，呼吸困难，皮肤特别是肢体末端皮肤充血发绀，部分猪还出现腹泻症状，体质弱，被毛粗乱。使用常见抗生素治疗效果不明显。

2病猪剖检病变观察

现场剖检的4头病死猪中，100%（4/4）病例肺脏均观察到暗红色的实变区，肺叶萎缩、出血，淋巴结特别是肺门淋巴结、肠系膜淋巴结严重出血，水肿，脾脏边缘有丘疹状突起呈锯齿状；75%（3/4）心包膜不透明、增厚、心包积液，心外膜附着纤维性渗出物并与心包黏连，肺与胸腔黏连；50%（2/4）肠道黏膜充血；25%（1/4）胃底腺出血，肾包膜下有针尖状出血点。在病猪会厌软骨、膀胱等处未见有明显的病变。

3实验室诊断

3.1细菌学检查

病猪胸腹腔剖开后，从心脏、肝脏、脾脏、肺和淋巴结用接种环无菌操作取样，在含鸡鲜血的琼脂培养基上划线进行细菌接种，37e厌氧和普通培养24h，从1头病猪病料分离到圆形、中等大小、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明微隆起、多而纯的菌，经染色后镜检为革兰氏阴性小杆菌。该细菌纯培养物在麦康凯琼脂平板上生长为无色透明菌落，能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，不发酵乳糖、蔗糖；甲基红试验阳性，不产生靛基质。细菌纯培养物与沙门氏菌多价血清（A-F群）进行平板凝集试验阳性，且能够凝集沙门氏菌单因子血清O7和鞭毛特异性抗原C。通过形态学、染色特征、生化图谱鉴定和凝集试验可以判定分离到的细菌为沙门氏菌，1头病猪存在沙门氏菌感染。

3.2蓝耳病病原核酸检测

取病猪肺和淋巴结，加适量无菌生理盐水研磨至匀浆，反复冻融3次后用Tizol法提取总RNA样本。针对PRRSV非结构蛋白基因NSP2选择合成引物，对提取的RNA样进行RT-PCR检测，同时以蓝耳病NVDC-JX-A1株作阳性对照，预扩增片段大小1064bp。上游引物P1：5.-CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT-3.，Tm=59.05e；下游引物P2：5.-CCTCCGTGGTGCAACAAATCTTG-3.，Tm=56.88e，用TE稀释到浓度为20Lm备用。RT-PCR反应体系：10@PCRbuffer5LL，MgCl210LL，dNTP5LL，P1和P2各1.5LL，Rnasin1LL，RTnase1LL，Taq酶1LL，样本RNA5LL，RNA模板5Lg，DEPC-HO2补足至50LL。RT-PCR循环参数：50e反转录50min，94e3min后，进入94e30s，56e30s，72e45s，34个循环，最后72e10min。反应结束后取5扩增产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后凝胶成像系统观察。

结果，4份待检病料提取的RNA样本，经RT-PCR扩增后均检测到特异性核酸片段，大小与作阳性对照的NVDC-JX-A1株相同，为1000bp～1100bp。NVDC-JX-A1全基因组序列已经测定，作为高致病性的PRRSV变异毒株代表之一，与经典的PRRSV毒株相比，NVDC-JX-A1株以上扩增区域缺失90个碱基，能够通过凝胶电泳进行区分。NSP2基因90个碱基缺失是高致病性PRRV的标志，本次检测的4个样本，通过电泳图可见与NVDC-JX-A1株相同，均为90个碱基缺失型的高致病性PRRSV变异毒株。因此，4头发病猪均有高致病性蓝耳病。

3.3猪瘟检测

取死猪扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏等处新鲜病料制备组织触片，干燥后滴加-20e冷丙酮室温固定，待丙酮完全挥发后用0.01M/L，pH7.2的PBS溶液反复漂洗5次，干燥后用中国兽医药品监察所生产的猪瘟荧光抗体染色，37e恒温孵育60min，取出用PBS漂洗6次，干燥后加磷酸甘油缓冲液封片，置荧光显微镜下观察。在检测的4头猪中，2头猪病料触片的细胞边缘胞质中观察到了特异性黄绿色荧光，这说明，有50%感染了猪瘟。

4小结与讨论

根据流行病学调查，病猪剖检病变观察和实验室诊断可以得出猪群为高致病性蓝耳病、猪瘟、沙门氏菌混合感染，检测的4头猪中，高致病性蓝耳病感染率为100%（4/4），猪瘟感染率50%（2/4），沙门氏菌感染率25%（1/4），高致病性蓝耳病和猪瘟可能是引起发病死亡的主要原因。猪群发病集中在仔猪群，估计为仔猪抵抗力较弱所致。

生产中最常见蓝耳病与猪瘟、猪圆环病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪链球菌、猪霍乱沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等混合或继发感染，从而增加感染猪死亡率，这可能与蓝耳病的免疫抑制有关。因此，猪群发生蓝耳病后，应预防病猪进一步继发感染其他细菌和病毒，以降低发病死亡率。虽然是否接种蓝耳病疫苗在实际养猪生产中有一定争议，但从长远看，疫苗预防蓝耳病有一定的积极意义。国内目前最常见的蓝耳病疫苗主要有CH-1a株灭活疫苗、NVDC-JX-A1株灭活疫苗、SD-1株灭活疫苗和CH-1r株弱毒活疫苗。其中，NVDC-JX-A1株基因组与国内近期流行的毒株有很高的同源性，被农业部推广使用。对猪瘟的预防，目前主要通过脾淋苗接种预防，猪场可通过提高母源抗体水平保护仔猪，避免仔猪发生非典型猪瘟，对已经发病的猪场，可进行脾淋苗紧急接种。与蓝耳病、猪瘟混合发生的细菌感染，可通过药物敏感试验筛选敏感药物进行治疗，可降低病猪死亡率。