猪小肠黏膜下层作为板层角膜移植材料的实验研究

小肠黏膜下组织（smallintestinal submucosa，SIS）是一种新型的具有生物降解性及胶原组织结构的细胞外基质框架，通常取自猪的空肠，SIS中的胶原蛋白、蛋白多糖及糖蛋白构成的细胞外基质框架无抗原性，植入体内仅引起轻微的排斥反应，可以在体内存活，同时为受体自身细胞的生长提供框架。由于SIS具有无免疫原性、抗微生物活性、促进组织再生等特性，因此得到了广泛研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

将4只健康的雄性家兔的术眼分别编号为a1、a2、a3、a4，家兔体重为2.0～2.5 kg，饲养于兔笼中并给予全价兔粮，饲养10天后，确认无任何眼部疾病。

1.2 SIS的制备

在无菌条件下取一段实验用猪空肠，长约10 cm，剪去肠系膜，使用小刀柄和纱布交替刮去空肠外膜层及肌层，翻转空肠，使黏膜层朝外，同法刮去黏膜上皮和固有层，再用清水反复冲洗，尽量洗掉残留的浆膜层和肌层，剩下一层约0.1 mm厚、白色半透明的薄膜即为SIS，储存于4℃ 100 μg/ml硫酸庆大霉素溶液中。

1.3 主要仪器

直径7.75 mm的角膜环钻，苏州医疗器械厂。直径7 mm的Hessburg-Barron负压环钻，美国。眼科手术器械包，苏州医疗器械厂。眼科手术显微镜，苏州医疗器械厂。H7500透射式电子显微镜，日本。

1.4 手术方法

采用846合剂对家兔进行全身麻醉，剂量为0.2ml/kg，同时配合使用0.5%利多卡因进行眼表局部麻醉。首先对术眼进行剃毛消毒，并用氯霉素眼药水冲洗结膜囊，使用儿科开睑器开张眼睑，在眼球的6点和12点位置分别用4/0丝线固定眼球。用直径为7 mm的负压环钻钻取0.25 mm的深度，仔细剥离板层角膜，要求剥离后植床尽量平整。植床制备好后，用直径7.75mm的角膜环钻在SIS上钻取植片。SIS移入植床后，先在3点、6点、9点和12点的位置上用11/0眼科缝线行间断缝合固定植片，然后进行连续缝合，将SIS缝合于植床上，缝合后将上述间断缝合固定线拆除。术后第15天拆除缝线，术后30天内每天给术眼涂抹红霉素眼药膏两次。于第60天给家兔耳静脉注入空气致死，取a1和正常角膜进行透射电镜观察。

Hessburg-Barron负压环钻的使用方法：(1)在手术显微镜下检查环钻，顺时针旋转

装于刀片顶部的白色塑料辐，使刀头边缘对齐真空室的内壁（零位）。(2)为保持负压，逆时针旋转4个轮辐360°，使刀头倒转后退一周。(3)用生理盐水湿润角膜表面。(4)将注射器针栓推至尽头，并保持住。(5)用非主导手的拇指、示指捏住白色塑料指柄，通过手术显微镜观察环钻中央的十字交叉丝交点与受体角膜的视轴是否重合。(6)在角膜前表面上均匀的下压环钻，并突然地松开注射器针栓，检查是否已形成负压，并足以吸住角膜。(7)确定环钻在正确的位置后等待大约30 s时间。(8)用非主导手的拇指和示指轻轻捏住环钻并稳定之，勿使下压或倾斜。(9)用主导手的示指顺时针拨4条轮辐，将刀头恢复零位。(10)顺时针旋转白色塑料轮辐开始切割。每旋转一圈（4条轮辐）刀头下降0.25 mm。(11)推下注射器针栓松开负压，从角膜上取下环钻。(12)用消毒棉签吸干角膜前表面，环钻吸引所形成的16条放射状压迹会渐渐消失。

1.5 临床评价术后每天分别观察家兔角膜对SIS的反应，包括结膜的充血水肿、角膜新生血管化、虹膜充血和植片周边角膜水肿。

1.6 电镜标本制作 2.5%戊二醛前固定20天后，1%四氧化锇后固定1 h，乙醇系列脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片约50 nm，铅、铀染色，透射电镜观察拍照。

2 试验结果

2.1 临床观察

术后4只家兔术眼结膜都出现了充血水肿、虹膜充血，并且在术后的第1天最为严重。随着时间的推移这些症状逐渐减轻，但每只术眼减轻的程度有所不同。4只术眼角膜于术后4～5天出现了角膜新生血管，随后这一症状逐渐加重，于术后不同时期分别达到各自的顶峰，然后开始慢慢消退，消退的进程也有所不同。a1于术后第5天出现新生血管，角膜血管化程度十分轻微，并于第18天完全消退。a2于术后第4天出现新生血管，第35天左右血管化程度达到了顶峰，到第60天时新生血管没有完全消退。A3于术后第4天出现新生血管，第20天左右血管化程度达到了顶峰，到第60天时新生血管也没有完全消退。A4于术后第4天出现新生血管，角膜血管化程度十分轻微，并于第22天完全消退。整个试验过程中都未出现植片周边角膜水肿。术后4只术眼角膜透明程度也有所不同，a1角膜新生血管消退后，角膜恢复正常的透明度，清晰可见瞳孔，但可以隐约见到SIS遗留下的残迹。a2角膜新生血管尽管在第60天时没有完全消退，但也可透过植片看到瞳孔。A3角膜也基本恢复到了正常的透明度，透过植片可清晰看到瞳孔。A4自始至终在整个试验过程中角膜植片始终不透明，无法见到瞳孔。

2.2 透射电镜观察

正常角膜的胶原纤维排列细密、有秩序，纤维较长。SIS不含细胞成分，完全是由胶原纤维构成，胶原纤维排列致密、有序，纤维比正常角膜中的胶原纤维较粗些。A1角膜胶原纤维排列已趋于正常，但是仍可见排列失序的胶原纤维，这可能是影响角膜透明度的主要原因(

见图1)。

图1 角膜胶原纤维排列情况（略）

3 讨论

深部角膜溃疡是小动物临床上十分常见的问题，需要准确的诊断和及时的治疗。目前有许多手术方法用来治疗此病，且每种方法各有其利弊。结膜瓣是最常用的手术治疗方法，虽然有证据显示对于治疗深部角膜溃疡是有效的，但此方法常常会造成角膜瘢痕化及色素沉着，影响角膜的透明度。角巩膜移植术、同种异体板层角膜移植术也是有效地治疗手段，这两种方法旨在替换受损的角膜基质并且促进受体角膜重新上皮化，以达到愈合的目的。由于同种异体板层角膜的储存技术还没有完全建立起来，因此限制了这一技术的推广。一些国外研究人员尝试使用容易获取的其他生物材料作为植片治疗角膜溃疡，以取代角膜材料，例如使用经过保存的人羊膜治疗深部角膜溃疡，以及在犬动物模型中，成功地使用了经保存的异种心包、肾囊治疗受损角膜。尽管如此，由于这些材料的准备及保存过程复杂，同样限制了这些技术的应用。而SIS取材方便，保存简单且不需要很专业的技术，因此备受重视。目前SIS这种生物材料

在国外已经商品化了，而在国内尽管没有商品化，但研究人员完全有能力自制，至于自制的SIS与国外商品化的SIS对角膜愈合是否存在影响，还需进一步研究。

目前研究发现SIS可使受体角膜产生轻度至中度的炎症反应，术后4只术眼都出现了暂时性的结膜炎和虹膜炎，这种非特异性反应很可能是由于手术本身造成的，因为众所周知兔眼对创伤非常敏感并且迅速发生炎症，主要包括结膜的充血水肿、虹膜充血、瞳孔缩小。尽管目前已知SIS不含活细胞、无免疫性。虽然，术前SIS植片的污染或术后感染也可能成为产生炎症的诱因，但是储存液中加入的庆大霉素以及术后每日涂抹红霉素眼药膏，已使发生这些诱因的可能性降到了最低。4只术眼于术后4～5天出现了角膜新生血管化，值得注意的是a3角膜血管化最为严重；a2次之；a1和a4最轻。这种不同可能是由于家兔的个体差异造成的，而不是SIS本身所致，这一结果与国外报道相一致。

SIS可作为生物支架促进创伤组织的愈合，最终胶原基质被降解，并且被宿主组织所取代。在组织损伤后，SIS之所以可以作为组织形态发育、结构重建的天然生物支架，最主要的还是由于SIS中的细胞外基质（ECM）具有适宜的结构和功能特性。目前已知SIS中含有胶原、蛋白聚糖、糖蛋白、氨基聚糖和各种生长因子，其中所含生长因子主要为：碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化因子β（TGF-β）。

角膜基质由角膜基质成纤维细胞和细胞外基质(ECM)构成，胶原是ECM的主要成分，而且角膜的透明度主要取决于胶原纤维排列有序性以及创面愈合的时间，创面越迟愈合越容易形成瘢痕。实验兔角膜切除板层后丢失部分基质细胞,损伤后基质成纤维细胞的生长速度慢于正常细胞，增加外源性细胞因子b-FGF后,损伤基质成纤维细胞生长速度显著加快，证明了b-FG F对成纤维细胞的增殖作用，可加速角膜基质创伤的修复，并且使基质层胶原纤维排列更有序。TGF-β促进ECM成分的合成，减少蛋白酶的合成，促进蛋白酶抑制剂的合成，促进细胞粘附受体的合成。在角膜伤口愈合,尤其是基质层的愈合中发挥着重要作用。因此，SIS的植入无异于添加了外源性生长因子，对减少角膜瘢痕的产生，维持角膜良好的透明度起到了重要的作用。但是试验发现在各种条件相同的情况下，术后SIS降解的程度差异比较大，SIS降解程度的差异是否与角膜血管化程度以及家兔个体差异有关目前尚不清楚。但是SIS的应用无疑拓展了角膜治疗学的应用前景，相信将来若能真正了解SIS的降解机制以及SIS中的生长因子与受体角膜的作用机制后，SIS植片有可能成为板层角膜移植材料的替代品。