低密度基因芯片技术在猪疫病检测中的应用

低密度基因芯片技术在猪疫病检测中的应用

程福亮

山东宝来利来生物工程股份有限公司

基因芯片技术是研究生物大分子功能的新技术，具有高通量、灵敏度高，特异性好等特点。它是通过微阵列技术，将高密度DNA片段阵列，通过点样或原位合成法的形式，以一定的顺序或者排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，借助碱基互补杂交原理，进行大量病原基因表达谱分析、检测、分型等。就芯片技术在动物传染性疾病检测中的应用而言，较为成熟的是低密度芯片，它在猪病检测的研究开发方面，取得了很好的成果，同时也暴露出了不少的弊端。文章就低密度基因芯片在猪疫病检测中的应用及其存在的问题和发展前景进行综述。

随着畜牧业养殖集约化的发展，动物生产过程中逐渐暴露出诸多问题，其中最为严重之一就是动物疫病，当前养殖业中面临着疾病频发，老病抬头，新病不断，免疫抑制病严重，细菌的继发感染普遍等现象，而多重感染扮演的角色已经粉墨登场。因此，对多种疫病同时做出诊断，及早制定和采取相应防制措施是现代动物疫病检疫新的发展方向。基因芯片在病原体检测方面具有独特的优势，它以高通量并行检测的方式，可以使病料中的多种病原体同时被检出，具有快速、高效、灵敏的特点，尤其适宜于大规模的样本检测。

1基因芯片

生物芯片技术是随着“人类基因组计划”的进展而发展起来的，生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。基因芯片又称cDNA微阵列（micro-array）、DNA芯片、寡核苷酸芯片（oligo-chip）。该方法是指以大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针，采用原位合成或合成点样方法将探针密集、规律地排列在支持载体上（硅片、载玻片或塑料片等），可实现对细胞、蛋白、核酸及其他生物组分准确、快捷、大信息检测。其重要性可以与上世纪50年代把单个晶体管组装成集成电路芯片相比，目前基因芯片广泛应用于基因表达谱分析、基因分型、敏感药物筛选等领域，并展示出良好的应用前景。在畜牧业生产中，对猪疫病的检测也已有较多报道。

2低密度基因芯片在猪疫病检测上的应用

目前，我国猪重大传染病流行的主要特点是多病原混合感染，繁殖障碍性传染病普遍存在，呼吸道传染病日益突出，给我国养猪业造成巨大的经济损失。目前对病毒性传染病的诊断多采用病原分离及常规的血清学方法进行，但病原分离不仅费时费力，而且敏感性和特异性都较差，血清学诊断方法也因实验室条件和诊断方法的不同而产生不同的差异。虽然已有PCR诊断方法应用于病毒检测，但需分别进行诊断。基因芯片技术具有高通量和并行化的特点，可以对成百上千甚至上万个基因进行同时、快速、准确的检测，从而很好地解决了这一问题。但由于其应用需要配置整套的仪器设备，并对操作人员具有较高的要求，并且目前高通量基因芯片所需的仪器大都价格昂贵，在畜牧业中普及使用基因芯片难度较大，所以多数对基因芯片的研究集中于单病毒的基因分型或少数病毒的低密度基因芯片检测，以期望获得更高的检测灵敏度和阳性检出率等。

2.1低密度芯片技术在猪病毒性病原体检测中的应用

郭瑶等采用连接酶检测反应LDR-PCR和基因芯片技术，检测和鉴别猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）和伪狂犬病病毒（PRV）在3种病毒的保守区内分别设计一对LDR探针，两端各连接一段通用序列，依次进行LDR、通用引物荧光标记扩增和芯片杂交，同时比较引物标记和Cy5-dCTP标记方法的灵敏度。利用建立的方法对41例临床样品进行检测，与普通PCR检测结果符合率为97.6%～100%。表明该方法可以特异地检测PCV2、PPV和PRV3种病毒。张伟等根据已发表的狂犬病病毒（RV）的序列，设计合成能扩增高度保守核（N）蛋白片段的一对引物。通过生物素标记PCR技术，将核（N）蛋白基因片段作为探针点在硝酸素纤维膜上，制作成疾病诊断基因芯片。取160份可疑动物的血液，提取核酸作模板进行PCR扩增，将其产物与诊断基因芯片进行特异性逆向点杂交检测；并用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化狂犬病病毒作抗原，建立检测RV抗体的间接ELISA。把以上两种方法应用于临床，结果基因芯片的检测率比ELISA方法和RT-PCR要高15%左右。姜永厚等建立一种可同时检测区分猪瘟病毒（CSFV），猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的寡核苷酸基因芯片方法，针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测，其中25个样本（32.9%）同时感染了2种以上病毒。郭焕成等建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法。

设计扩增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失区域的Nsp2基因片段的二重PCR引物，并设计长度为31nt～35nt的美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株Nsp2基因缺失区域的探针。建立的寡核苷酸芯片方法能够准确鉴别高致病性PRRSV#Nsp2缺失变异株。杨林等根据猪流感病毒（SIV）的M基因序列设计了1对特异性引物M1/M2，扩增出大小为229bp的目的片段。针对这个基因片段，再设计合成4条寡核苷酸探针，其中反向引物的5′端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础，通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测。利用该方法对39份猪组织样品进行检测，本方法具有良好的特异性和敏感性。张焕容等在前人研究基础之上，制备了猪伪狂犬病病毒（PRV）猪细小病毒（PPV）和猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）3种引起猪繁殖障碍的病毒性传染病检测基因芯片，并进行了该基因芯片的检测方法研究。结果表明，PRV-PPV-JEV检测基因芯片具有良好的特异性，且该检测系统的灵敏度高达3pg/mL。符芳等用猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）的特异cDVA片段作为探针制备的cDNA微阵列芯片，可以用微量病猪全血一次同时快速、准确地对上述5种病毒进行特异性检测，展示了基因芯片技术在动物疾病诊断与防制上有着极高的应用价值。

BanerMK等报道了区别由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV）、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒引起的猪在临床上的相同症状的鉴别基因芯片，对代表3个不同病毒的不同来源的39个cDNA样品进行了分析，取得了与PCR鉴定方法完全一致的结果。通过利用基因芯片，为大批量快速诊断、普查猪病毒性疫病提供了保证。杨若松等建立猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型及猪细小病毒的基因芯片检测方法，该方法对临床150份样品的检测结果显示，CSFV阳性样品有25份，高致病性PRRSV阳性样品有45份，PCV-2阳性样品有70份，PPV的检测结果全部为阴性，其中混合感染样品有18份，结果表明该法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

2.2低密度基因芯片技术在猪细菌性病原体检测中的应用

肖国生等利用胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌的7个从3种病菌基因组中扩增出不同特异性靶DNA制作基因芯片，并对芯片的靶DNA和探针浓度、杂交温度、重复性、特异性和灵敏度进行了研究。试验结果证明，其所研制的基因芯片特异性强、灵敏度高能检测到10pg～50pg基组DNA，且芯片可重复利用，是一种能有效用于胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪肺炎支原体鉴定和联合检测的新工具。郑峰等采用点样法制备基因芯片，对于猪链球菌的种、致病血清型和毒力因子初步建立基因芯片检测体系，其敏感性与特异性高，对于高通量鉴定猪链球菌菌种及其毒力有重要价值。徐晓静等应用点样法制备基因芯片，制备的基因芯片对能涉及4个菌属的23株肠道菌在相同的条件下进行了杂交检测，得到菌属特异性的杂交图谱，从而达到对细菌进行检测鉴定。对于未知菌落，利用其制备的基因芯片能够在4小时之内完成细菌菌属的鉴定。

3结论与展望

基因芯片技术作为新诞生却备受关注的新技术，已广泛应用到诸多领域，并呈现出了很好的优势，比如高度的灵敏性和准确性、快速简便、可同时检测多种病原等。另外，基因芯片产业具有广阔的商业前景，国内已有许多生物芯片产业公司成立运作，人医已有10余个应用芯片技术开发的检测试剂盒被政府批准使用。但同时有学者指出基因芯片技术作为一种预警检测测手段还不稳定，应慎重选择。低密度基因芯片技术应用在猪病检测中同样面临着诸多的问题，首先芯片技术配套的仪器大都昂贵，尤其是荧光读取仪，目前国内外研制的低密度芯片所配套的化学发光读取仪，成本相对较低，但在畜牧业中基层从业人员接受难度仍然较大；其次是基因芯片技术的应用对从业人员的技术水平要求较高，芯片应用步骤较多，操作稍有不当，就会影响检测结果。低密度芯片检测还存在不同程度的假阳性，重复性也有差异，结果难以分析，信号检测的灵敏度需要增加等问题；

此外，样品制备和标记还比较复杂，各研究机构中仍没有一个统一的质量控制标准，各实验室不能分享数据和资料库等。还有目前国内尚无对基因芯片技术实施标准化，对低密度芯片应用的准确性和可操作性缺乏有效的评判机制。因此，低密度芯片技术在动物检测方面的终极研究目标是获得易于在基层检测单位或企业推广使用，能够有效地解决传统基因芯片在应用过程中，需要大型检测设备、不便于推广的瓶颈问题，既经济又稳定的新型基因芯片技术。这一新型基因芯片技术的诞生必定会为动物疾病的诊断和疾病的预防提供一个重要的研究和应用平台。