猪圆环病毒病2型诊断技术的研究进展

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是1974年德国学者Tischer从PK15细胞中发现的一种不产生细胞病变的污染病毒，开始一直未被重视，所以在猪群中广泛传播。直到1982年Tischer等通过实验分离鉴定了该病毒后将其命名为猪圆环病毒，PCV隶属于圆环病毒科、圆环病毒属，基因组为单股单股负链闭合环状DNA病毒。病毒粒子直径为14～25 nm，为二十面体对称结构，无囊膜，是迄今为止发现的一种最小的脊椎动物病毒。根据其致病性、抗原性以及核酸序列的不同，将其分为无致病性的PCV-1型和致病性的PCV2型。两种基因型的基因组序列长度不一样，前者为1 759 bp，后者为1 767 bp或1 768 bp。现在许多国家的猪圆环病毒感染都是PCV2感染。PCV2在临床上主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性间质性肺炎(PNP)、母猪繁殖障碍等疾病有关。此外，PCV2还侵害机体的免疫系统，增加其他病毒和细菌感染的几率，从而导致猪群的死亡率增加。近年来PMWS在我国猪群中呈流行趋势，造成了很大的经济损失。由于猪群中普遍存在PCV抗体，血清学诊断结果并不准确可靠，所以本病的诊断工作一般都在病猪死亡后进行。同时，PMWS的症状和病变与猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)基本相似，所以仅凭症状、病理变化及流行病学调查很难做出准确的判断。目前，对PCV2的诊断主要是先通过临床症状结合病理变化进行初步判定，再结合实验室检验来确诊。本文将主要对PCV2的实验室诊断方法进行综述，以便为临床上猪圆环病毒病2型的确诊提供依据。现将猪圆环病毒病2型诊断技术综述如下。

1病原学诊断

1.1病毒的分离鉴定

采集PMWS病死猪肺、肝、脾、扁桃体及淋巴结等组织研磨制成病料与PBS液体积比为1：5的悬液，在-20 ℃反复冻融3次后12 000 r/min离心20 min，取上清液用220 nm滤器过滤后接种于已长成单层且无PCV污染的PK-15细胞，37 ℃吸附1 h(期间每15 min轻摇一次)，然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM细胞维持液，37℃培养24 h后倒掉细胞培养液，用300 mmol/L D-氨基葡萄糖处理后用pH为7.4的10 mmol/L无菌PBS洗涤2次，然后加入5 mL含2%胎牛血清的MEM/DMEM细胞维持液，37 ℃培养48～72 h后传代培养，12 h后用300 mmol/L D-氨基葡萄糖溶液处理30 min，弃去D-氨基葡萄糖用pH为7.4的10 mmol/L无菌PBS洗涤2次，然后加入10%胎牛血清的MEM细胞营养液培养，因为PCV2接种细胞后不产生细胞病变(CPE)，需连续盲传1-3代后进行PCV2抗原或核酸的检测加以鉴定，也可用免疫荧光技术(IFA)检测病毒的生长情况，或者借助电镜技术和超薄切片法来观察PCV病毒粒子。本方法费时费力，不适于临床上疾病的快速诊断。

在我国，郎洪武等用猪肾传代细胞Dulac株分离到了2株猪圆环病毒。汤德元等将贵州分离到的猪圆环病毒提取的DNA通过PCR技术扩增PCV ORF2基因，克隆到pMD19-T载体并测序，后将构建好的T载体双酶切，然后将回收的目的片段与pET-32a(+)载体及pcDNA3.1(+)载体连接并转化入感受态细胞TOP10中构建原核及真核表达载体，并将ORF2基因插到重组质粒pcDNA3.1-IL-2上，构建以IL-2融合表达真核载体。结果表明：克隆的PCV ORF2基因全长为719bp，ORF为702 bp，编码233个氨基酸，与GenBank公布的PCV ORF2基因的核苷酸同源性为98.4%。国内很多研究人员分别从各地的病猪上分离到了多株猪圆环病毒。

1.2电镜观察法

利用电镜技术将感染猪淋巴或病毒细胞培养物制成切片在电镜下观察，则可从平面上观察到病毒的内部结构，形态大小，复制方式等，再结合病毒自身所具有的形态、大小及结构等不同特征即可对观察到的病毒做出准确的判断。

G W Steveson等在透射电镜下观察感染PCV2的PK-15细胞，将细胞病毒液反复冻融3次，8 000 r/min离心30 min后弃沉淀再将上清液40 000 r/min超速离心3 h，弃掉上清液，用0.01 mol/L pH 8.0的TE缓冲液重悬沉淀并收集，通过透射电镜观察到了PCV2，并首次详细描述了细胞的胞浆与细胞核内的病毒包涵体及病毒粒子的形态。