猪呼吸道疾病综合征4种病原菌复合PCR方法建立及其初步用

猪呼吸道疾病综合征4种病原菌复合PCR方法建立及其初步用

赵洪武 李郁 孙裴 刘文 赵东 魏建忠

安徽农业大学动物科技学院 合肥华杰畜禽养殖有限公司 阜阳市动物卫生监督所

猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory diseaseComplex，PRDC）是由多种因素引起的猪呼吸道疾病的总称，临床表现为发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、腹式呼吸、眼鼻分泌物增多、厌食、迅速消瘦、皮毛粗乱，可发生突然死亡。发病率为5%~60%，病死率为20%~90%。仔猪断奶后，尤其至18周龄~20周龄的育成猪，临床症状表现明显，猪群危害程度严重，故被称为“呼吸道病18周龄墙”。

引发PRDC的因素众多，病毒、细菌、支原体、寄生虫、环境因素、断奶转群应激和猪体免疫力低下等因素相互作用均能造成PRDC。病原中包括猪呼吸与繁殖障碍病综合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）、猪呼吸道冠状病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）、猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）、猪细环病毒（Swine Torqueteno virus，TTV）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopne-umoniae.Mhp）、猪链球菌（Streptococcus suis,SS）、猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）、猪霍乱沙门菌（Swine Salmonella choleraesuis，SC）等，其中Mhp、PRR-SV和PCV2是PRDC常见原发性病原体，而SS、HPS、Pm则是常见继发性病原菌。

临床上常规分离培养法用于Mhp、SS、HPS和Pm的鉴定，不仅耗时长，且要求条件高，不能满足生产的需求。本实验旨在建立检测Mhp、SS、HPS、Pm的四重PCR方法，从而为临床快速鉴定及流行病学调查研究提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 样品

来自安徽省合肥、六安、淮北、滁州、安庆、蚌埠、毫州等地猪场，临床表现PRDC猪群，无菌采集鼻腔拭子样品60份及其相应的肺脏组织样品60份。

1.2 参考

菌株胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumomae，APP）、Mhp分由山东农业大学刁有祥教授、江苏农业科学院邵国青研究员馈赠；金黄葡萄球菌（S.aureus，CMCC26112）、E.coli（CMCC-44113）购白中国食品药品检定研究院；Pm、HPS、SS、SC、鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、PRRSV、PCV2、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）由安徽农业大学动物传染病实验室分离鉴定保存；正常肺组织来源于健康猪的肺脏。

1.3 主要试剂

用于细菌分离培养时胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE）购白绍兴天恒生物科技有限公司；胎牛血清、HPS分离培养时的营养因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleo-tide，NAD）、蛋白酶K、DNA marker DL2000均购白生工生物工程（上海）股份有限公司；Taq DNA聚合酶、MgCl：、dNTPs均购白宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购白天根生化科技有限公司。

1.4 引物设计及合成

根据GenBank中登录的Mhp的P36基因序列（登录号：CP002274.1和AE017243.1），运用Primer5.0软件设计引物，上游：5'-CAGCGGGAAGACCACAAAAAC-3'，下游：5'-CG-TGAAATCCGTATTCTCCTCGTA-3'，扩增片段大小为568bp。同时参考文献分别合成SS、HPS和Pm的特异性引物，SS的16S rRNA基因上漩引物：5'-CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT-3'，下游引物：5'-GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA-3'，扩增片段大小为294bp；HPS的16S rRNA基因上游引物：5'-GTG-ATGAGGAAGGGTGGTGT-3'，下游引物：5'-GGCTTC-GTCACCCTCTGT-3'，扩增片段大小为821bp；Pm的KMT基因上游引物：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTG-G-3'，下游引物：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'，扩增片段大小为457bp。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 细菌基因组DNA的提取

根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，置-20℃保存。

1.6 四重PCR体系的优化

退火温度的确定应用单一PCR体系，其他条件不变，以不同的温度（60.0、59.5、58.6、57.2、55.5、54.3、53.5、53.0℃）进行扩增，上下游引物各0.5μL。

反应体系中Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs最佳条件匹配的优化在相同退火温度条件下，设计4因素（Taq酶、Mg2+、引韧、dNTPs）4水平的Ll6（44）正交试验进行反应体系优化，见表1。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝聚电泳鉴定。

1.7 四重PCR方法的验证

1.7.1特异性验证

应用优化的四重PCR方法检测APP、SC、E．coli、RA、s.aureus，及鉴定为阳性的PRRSV cDNA、CSFV cDNA、PCV2 DNA、PRV DNA、正常肺组织DNA，同时以双蒸水（ddH20）、灭菌PBS为空白对照，分析该方法的特异性。

表1

1.7.2敏感性验证

按1.5项方法提取Mhp、SS、HPS和Pm的基因组DNA，用紫外分光光度计测定含量，分别进行10倍梯度稀释，用优化后的4重PCR法进行扩增，分析该方法的敏感性。

1.7.3重复性验证

应用优化后的四重PCR方法分别对Mhp、SS、HPS和Pm基因DNA模板进行8次重复PCR扩增，分析该法的重复性。

1.8 初步应用

分别提取60份PRDC猪的鼻腔拭子样品及其相应的60份肺脏组织样品的基因组DNA。应用建立的四重PCR、单一PCR方法同时对样品进行检测，另对肺脏组织样品进行SS、HPS、Pm的常规分离鉴定。

1.9 统计学分析

采用SAS9.1.3软件进行统计学分析，组间、组内比较分别采用t、u检验，以P<0.05为差异有统计学意义。< p="">

2 结果

2.1 四重PCR方法的优化

正交实验结果显示，试验组10是最适宜的Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs反应体系配对，见图1。最终确定的PCR反应体系为：10×buffer PCR（Mgz+ free）2.5μL，25mmol/MgCl2 2.0μL，dNTPs（10mmol/L）2.0μLUp and Down stream mixed primer（10pmol）2.5μL，DNA polymerase（5U/V，l）0.75μL，DNA模板4.0μL，补足ddH20至25μL。反应条件为：95℃预变。5min：94℃变性30s，58.5℃退火30s，72℃延50s，共35个循环；72℃再延伸10min。不同模组合可特异性地扩增目的片段，无非特异性条带增，见图2。

2.2 方法的特异性

检测结果显示，该方法可特异性地扩增Mhp、SS、HPS、Pm特异性目的片段，而APP、S.aureus、E.coli、Salmonella、RA以及鉴定为阳性的PRRSV cDNA、CSFV cDNA、PCV2 DNA、PRV DNA、正常肺组织、双蒸水、灭菌PBS扩增结果均为阴性，见图3。

2.3 方法的敏感性

检测结果显示，该方法检测Mhp、SS、HPS和Pm的最低检测限量分别为560pg、260pg、280pg和200pg，见图4。

2.4 方法的重复性

检测结果显示，8次重复扩增后的电泳结果一致，见图5。

2.5 方法的初步应用

检测结果显示，四重PCR和单一PCR方法检测60份鼻腔拭子样品的结果显示，Mhp阳性率分别为3.3%和6.7%，SS的阳性率均为36.7%，HPS的阳性率分别为61.7%和65.0%，Pm的阳性率均为30.0%，两种方法的阳性检出率差异均无统计学意义（t=1.732．P>0.05）。四重PCR和单一PCR方法检测60份肺脏组织样品的结果显示，Mhp的阳性率分别为0和1.7%，SS的阳性率分别为25.0%和28.3%，HPS的阳性率分别为18.3%和20.0%，Pm的阳性率分别为11.7%和13.3%，两种方法的阳性检出率差异均无统计学意义（t=1.604，P>0.05）。常规细菌分离鉴定60份肺脏组织样品的结果显示，SS阳性率为20.0%，Pm阳性率为6.7%，与四重PCR和单一PCR方法比较，差异无统计学意义（u值分别为0.853和0.913，P>0.05），而HPS阳性率为5.0%，差异有统计学意义（u=4.876，P<0.05）。< p="">

3 讨论

引发PRDC的病原种类复杂，Mhp、SS、HPS、Pm则多见于PRRSV、PCV2等的继发感染或与其混合感染，给养猪业造成巨大损失。安徽地区猪群主要病原感染情况的调查结果显示，PRRSV阳性感染率为55.56%，PCV2为74.36%，SS为14.0%，HPS为30.8%，Pm为41.0%。关于安徽地区猪群中Mhp的感染情况尚未见报道。目前，针对Mhp、SS、HPS和Pm的PCR检测方法多为单一PCR或二重PCR方法，不能满足临床上对快速诊断、及早控制疾病的要求。因此，建立同步检测Mhp、SS、HPS、Pm的PCR检测方法具有重要意义。

影响复合PCR方法的因素较多，主要有引物、反应体系（Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs）、退火温度、循环数以及每个PCR循环中变性、退火、延伸时间等。本研究在对四重PCR反应体系和反应条件优化的基础上进行了8次重复，检测结果均一致，稳定性和重复性良好；对Mhp、SS、HPS、Pm的DNA最低检测限量分别为560pg、260pg、280pg、200pg，且对常见的其他PRDC病原无非特异性扩增。临床初步应用结果表明，本研究建立的四重PCR和单一PCR方法间的检测结果不仅无差异，且在3h内可同步检测4种病原菌，表明该法简便、快速、经济。此外，对肺脏组织样品进行SS、HPS、Pm的常规分离鉴定，HPS的阳性检出率与四重PCR、单一PCR之间均存在显著差异，这可能由于临床抗生素的使用，造成检出率与实际感染率差异较大；同时，由于分离培养Mhp需要醋酸铊等特殊抑制剂，导致临床上分离培养难以成功实现。

综上所述，本研究建立的四重PCR方法具有良好的特异性、灵敏性、稳定性、重复性及快速简便的特点，不仅可直接用于临床PRDC 4种病原菌的鉴定，也为开展PRDC流行病学调查提供了有效的技术手段。