猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌ActinobacilJusPleuropneumoniae，APP)引起的猪的呼吸道疾病，能引起各个年龄的猪急性和慢性感染，是一种致死性和高度接触性的传染病。以急性出血性纤维素性胸膜炎和出血性肺炎为主要特征，急性病例死亡率可达80％以上，慢性经过者生长发育受阻，易继发其他病原感染而死亡。自1957年Pattison首次报道后，此后该病逐渐扩散至世界各地，在美洲、欧洲、澳大利亚、亚洲等地均有流行，但各地方所流行的血清型不尽相同，给该病的防治带来相当的困难。目前该病在全世界很多国家广泛流行，是国际公认的危害现代养猪业的重要传染病之一，给全球的养猪业造成严重的经济损失。随着我国养猪业迅速的发展，种猪的引进与跨省区运输对胸膜肺炎放线杆菌在我国各省区广泛流行起到了重要的提速作用，近年来该病呈上升趋势，大部分省市对此均有报道。温清萍等(2006)对广东省东莞市规模化猪场血清样品检测结果显示APP种猪群阳性率最高，弱毒株抗体阳性率为52．65％，强毒株抗体阳性率为20．00％，育肥猪221份的弱毒株抗体阳性率为l4．03％，强毒株抗体阳性率为7．69％，仔猪112份的弱毒株抗体阳性率为17．86％，强毒株抗体阳性率为5．36％；任荣清等(2008)对贵州省部分地区的猪群及个别散养猪449份血清样品进行检测，结果显示APP平均阳性率为36．9％；李任峰等(2008)对河南周口地区14个规模化猪场544份血液样品进行检测，总的阳性检出率为27．4％。说明当前我国APP流行依然较严重，疫苗作为该病预防控制非常重要的一个方面，一直以来受到兽医研究人员的重视，近年来伴随着分子生物学技术的快速发展与应用，猪传染性胸膜肺炎新型疫苗研究取得了长足进展，积累了丰富的资料，现就APP新型疫苗研究方面的进展做一简要的阐述。

1APP弱毒疫苗研究

目前预防猪传染性胸膜肺炎的商业化疫苗仍然以灭活全细菌疫苗为主，这些疫苗一般可以降低病猪死亡率，但不能降低发病率和慢性感染，由于慢性感染影响猪的生长速度，降低饲料报酬，给养猪业造成巨大损失。但是与这种全细菌灭活疫苗相比，人们从临床上观察到，无论是自然感染还是通过人工方法感染APP后存活的猪均获得了对所有血清型菌株再次感染的免疫保护力，暗示病原在体内而不是体外产生一些保护性抗原或免疫原复合物，这同时也表明弱毒活疫苗菌株有能力产生这些保护性抗原或免疫原成分，从而刺激机体产生针对所有血清型APP攻击后广泛的交叉保护。这些弱毒APP菌株，如荚膜缺失菌株，溶血素缺失菌株等已经作为疫苗被证实可以产生很好的保护。

Rosendal等(1990)将APP血清l型在体外采用连续传代培养的方法，使其荚膜发生改变，而其他成份如OmlA、Apx毒素等未发生变化，结果菌株毒力减弱但仍具有一定的免疫效果。Inzana等(1993)通过乙基甲硫酸对APP进行诱发突变，使突变菌株的荚膜完全缺失，LPS、Apx毒素未发生改变，但毒力却大大减弱，得到了安全、稳定而有效的无荚膜突变株。以大于亲本株LD的剂量经气管接种动物，当用同型或异型APP菌对动物进行攻毒，不仅没有出现临床症状和肺损伤现象，而且突变株对动物产生了很好的保护力。虽然荚膜抗体不能对动物提供充分的保护，但荚膜却为APP的毒力所必需。所以荚膜缺失的菌株在毒力减弱的同时，并不影响其保护力。Fuller等(1996)通过缺失核黄素生物合成操纵子(ribGBAH)一部分基因后，用含有卡那霉素抗性基因表达盒来取代这部分基因，利用同源重组技术获得了核黄素合成酶突变株，该突变株与亲本菌株相比毒力明显降低。随后他在2000年通过试验证实，把这种弱毒突变菌株作为弱毒活疫苗，肌肉免疫动物可产生显著的免疫保护力，可以抵抗APP野毒的攻击。Prideaux等(1998)利用插入失活的方法把含有apxIA基因的一个表达质粒插入到己经分离到的一株天然缺失结构毒素ApxIA和翻译后激活蛋白ApxIC但仍保留分泌必须基因apxIB和apxID的APP血清7型APP突变株，构建了表达无活性Apxl蛋白的弱毒菌株，免疫小鼠后证实在小鼠模型是致弱的且能诱导小鼠产生Apx特异性抗体，不仅能抵抗APP血清型7型的攻击，而且能对异源血清l型也产生了较好的保护力。Prideaux等(1999)通过使用位点特异性突变构建了apxlIC基因插入失活的基因工程突变株，该弱毒菌可以持续而安全地表达无活性的ApxlIA毒素。突变株经鼻腔内接种动物，不仅毒力降低，而且能诱导动物产生针对不同血清型APP攻击的交叉保护。

Ingham等(2002)利用插入失活，通过amp8基因表达盒的插入获得了aroQ失活的I型APP致弱株，类似于核黄素合成酶缺失菌株，该致弱株在猪的毒力试验证实其毒力大大降低，但其在体内的生存能力较差。Tonpitak等(2002)构建APP血清2型脲酶基因(ureC)和毒素Il基因(ApxⅡA)双基因缺失突变株，与亲本菌比毒力明显降低。一次免疫后保护效果和灭活苗两次免疫效果相当，而且肺部细菌含量大为降低，取得了和菌影疫苗同样阻止细菌定居的效果。Jacobsen等(2005)通过荧光素酶基因插入构建了APPaspA基因突变株，毒力大大降低，免疫猪攻毒后引起很少的肺部病变。Liu等(2007)构建APP双基因突变弱毒株apxllC么apxIvA，动物试验结果显示该突变株保持相似免疫原性并诱导猪群产生相应的保护性免疫水平，可以抵抗致死剂量的异血清l型APP的攻击，有望发展为标记性活疫苗用于不同血清型APP间的预防免疫接种。

2APPn疫苗研究

目前APP的疫苗一般是采用肌肉注射的方法进行免疫。注射免疫操作困难，而且肌注普通的细菌灭活苗往往对注射部位造成损伤，易引起猪群紧张，及伴随的炎症反应、肌体发热等副作用，特别对初生仔猪往往造成很大伤害。与其他呼吸道病原菌一样，胸膜肺炎放线杆菌也是通过黏膜表面进入宿主。研究发现，用口服疫苗剂量就能够诱导很高的免疫反应，当第2次免疫时加大l0倍的剂量，动物能够克服免疫耐受，维持很高的系统免疫。人们期望开发一种能诱导黏膜免疫反应的疫苗，同时尽可能地解决上述问题，于是开始尝试开发猪胸膜肺炎的口服疫苗作为一种新的防治手段。

Shin等(2005)将APP毒力因子ApxIIA基因分别在酿酒酵母和烟草中表达，然后以小鼠为模型研究了在酿酒酵母和烟草中表达蛋白的免疫效果。用田问分离株对所有的试验组进行人工感染，24h观察结果显示，表达蛋白5mg免疫剂量组在任一时刻的存活率均高于其他组。阴性对照组和免疫仅带有质粒YEpGPD的酿酒酵母2805组在人工感染6h后的生存率少于20％，在18h后小鼠全部死亡。抗ApxⅡA的抗体IgA和IgQ效价上升与免疫时的口服剂量呈正相关，这表明黏膜和系统的免疫力可由口服疫苗诱导产生。同样，Shin等(2005)利用啤酒酵母系统表达了胸膜肺炎放线杆菌ApxllA蛋白后发展了一种口服疫苗。小鼠试验进一步证实，表达蛋白具有很好免疫原性；通过检测特异性4/A的IgA和IgG抗体，还证实了这种口服疫苗可以诱导有效的黏膜和系统免疫反应。

伴随微胶囊技术的迅速发展，微胶囊技术在养殖业也越来越受到重视，人们开始着手胸膜肺炎肠溶性微胶囊口服疫苗研制就是很好的例子。Hensel等(1995)利用灭活的9型菌对猪进行口服免疫，发现肺部和全身都产生抗体，并且攻毒后具有保护力，说明了开发口服疫苗的可能性。Lia0等(2001)利用乙基纤维素包覆技术，成功开发出胸膜肺炎肠溶性微胶囊口服疫苗，将灭活后APPl型菌包裹于微胶囊中，对小鼠灌胃后进行抗体检测，发现小肠产生了很高的黏膜IgA抗体，但与灭活苗相比，口服肠溶性微胶囊疫苗产生的IgG抗体较低。Lia0等(2003)利用猪和小鼠对这种疫苗的保护性进行了研究，并和普通的全细菌灭活苗进行了对比，发现调整免疫剂量和时间后，微胶囊口服疫苗所产生的菌体抗体和黏膜IgA抗体均比全细菌灭活苗高，而且同型菌攻毒后产生的保护也比全细菌灭活苗好。不断改进的微胶囊口服疫苗，为预防猪传染性胸膜肺炎很有希望的新型疫苗。

3APP菌影疫苗研究

菌影疫苗(ghostsvaccine)是利用噬菌体FXl74的E基因在细菌中表达引起细菌的裂解失活而制备。通过控制噬菌体FXl74的E基因表达来生产整个细胞衣壳，该方法没有变性过程，这些空的细胞衣壳具有与其活的细菌一样的抗原决定簇，因而具有良好的免疫原性。这种E基因介导的溶菌作用已经在许多革兰氏阴性菌中得到实现，包括大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎杆菌等。菌影疫苗可以同时激发机体对抵抗感染的保护性抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答，能够阻止动物的带菌状态，因而是一种很有前景的疫苗。

Hensel等(1996)首先描述了APP菌影疫苗对猪的免疫效果，气雾免疫后用同型菌攻击获得了完全的保护，而且从扁桃体、肺脏、肺气管洗出物中均没有分离到攻毒菌株。Hensel等(2000)用APP血清9型菌的菌影疫苗2次免疫动物后攻毒发现，和甲醛灭活苗相比，菌影疫苗组的血清IgA水平较高，但IgM，IgG(Fc’)、IgG(H+L)抗体均没有灭活苗高。但细菌分离结果表明，主要针对细菌非变性表面抗原的抗体对阻止细菌的定居和感染起着重要的作用。Haslberger等(2000)研究表明，对于Thl诱导的免疫反应，细菌ghosts疫苗能有效刺激单核细胞和巨噬细胞。Huter等(2000)对菌影疫苗和灭活苗的抗原性成分进行比较，SDS