猪病毒性腹泻疫苗的研究进展

目前,病毒性腹泻是我国猪的常见病、多发病,引起腹泻的病毒种类较多,但危害严重的主要有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PRV)3种,其中TGEV和PEDV属于冠状病毒属,PRV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属。PEDV和TGEV可导致仔猪死亡率升高,用任何抗生素和中药治疗均无效;轮状病毒(RV)在猪群中感染率很高。目前,临床上很难区分由这3种病毒引起的病毒性腹泻,并且有时呈混合性感染,被感染的猪因腹泻可引起生长迟缓、饲料报酬降低,其所造成的经济损失无法估计,是长期以来困扰世界养猪业发展的难题。我国对猪病毒性腹泻的控制主要以免疫预防为主,现将这3种猪病毒性腹泻疫苗的研究进展概述如下。

1猪传染性胃肠炎疫苗

猪传染性胃肠炎(TGE)是猪的一种高度接触性肠道传染病。TGEV只有1个血清型,在这3种病中危害最大。自1946年发现此病后就开始研究其免疫控制技术,大致经历了3个阶段,现介绍如下。

1.1人工感染强毒

在TGE被确认后的较长时间内,许多国家采用强毒免疫母猪的方法,尽管TGEV强毒免疫妊娠母猪对其仔猪会产生良好的保护效果,但TGEV强毒易使仔猪发病,有扩大疫病的危险性,因此已很少使用。

1.2常规疫苗

1996年,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联灭活苗通过了鉴定;2004年,又研制了猪病毒性腹泻二联疫苗,并获得了国家科技进步二等奖。灭活苗解决了疫病潜在扩大、蔓延的危险性,但其免疫应答产生较慢,不能激发产生以IgA抗体为主的黏膜免疫反应,且制苗成本昂贵。弱毒苗能刺激黏膜免疫且肌肉注射产生抗体的时间快,抗体水平高,欧美等国家现使用的疫苗主要是弱毒苗。

1.3基因工程疫苗

1.3.1基因工程亚单位疫苗主要是利用各种表达系统表达S蛋白制成重组亚单位疫苗。Godet等人把TGEVS蛋白的基因插到苜蓿银蚊核型多角体病毒基因组中,转染Pvl941,用重组病毒感染sf9昆虫细胞,结果有分子质量为175ku的多肽合成,这种多肽发生三聚化并易位到细胞表面成为S蛋白,表现出与TGEVS蛋白相似的抗原性,且能诱导免疫鼠体内产生高水平的中和抗体。

1.3.2重组活载体疫苗目前,TGE重组病毒疫苗的研究相对来说比较多,研究证明这种疫苗效果很不错。Tamas等人报道,将全长或长为212kb的TGEVS基因插到猪血清型5腺病毒(pADV-5)基因组E3区中,转染ST细胞,Northern杂交分析表明S基因得到表达,用重组病毒免疫猪(口服)未出现临床症状,ELISA检测发现了TGEV中和抗体,在免疫猪的肺脏、小肠中均检测到了IgA。

1.3.3合成肽疫苗Anton研究发现,在B细胞上的2种抗原决定部位将肠道TGEV的S糖蛋白克隆到E.coli细胞表面CS31A纤维的CipG区,再用重组嵌合体免疫小鼠,可诱导产生边缘性TGEV中和抗体反应,这足以证实将合成肽疫苗应用到生产实践中是完全可行的。

1.3.4转基因植物疫苗2000年,Gomez等人将TGEV的S糖蛋白的N端结构域转到马铃薯中制成转基因马铃薯,用这种马铃薯块茎直接喂小鼠,小鼠体内可产生抗S蛋白的特异性血清抗体。

1.3.5基因缺失疫苗该疫苗是使病毒的某一基因完全缺失或发生突变从而减弱其毒力,感染宿主只能诱发保护性免疫而不会引起疾病的发生。Riffault等人的研究发现,缺失S基因的TGEV能诱导IFN-α分泌,由于其缺失S基因,不会产生任何毒性。这为研制TGEV基因缺失疫苗奠定了一定基础。

1.3.6RNA复制子疫苗RNA复制子是具有自主复制能力的RNA,保留了病毒复制酶基因,而结构蛋白基因缺失并由外源基因取代,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因高水平表达。TGEV是单股正链RNA病毒,适合制成RNA复制子疫苗。2001年,Kristopher等人用绿色荧光蛋白替换TGEV基因组中的ORF3a构建TGEV-GFP重组体并转染BHK细胞,结果能分离到有效表达GFP的TGEF-GFP2重组体。这说明可以考虑利用TGEV复制子研制TGEVRNA复制子疫苗。

2猪流行性腹泻疫苗

猪流行性腹泻(PED)是由PEDV引起的一种急性肠道传染病,临床上以腹泻、呕吐和脱水为特征。目前,在以烟草花叶病毒为载体的无烟碱烟草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表达,用表达蛋白免疫接种后,对仔猪具有良好的保护作用,为PEDV转基因植物疫苗的研究奠定了基础。一些研究者将PEDV的E基因和M基因导入甲病毒载体中,在BHK221细胞中得到了成功表达,这为进一步探讨E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定了基础。

3猪轮状病毒疫苗

3.1第1代RV疫苗(口服弱毒活疫苗)

由于人轮状病毒(HRV)和动物RV有组、亚组及某些血清型的共同抗原性相关蛋白,并且动物的RV更易在组织培养中生长,因此人们考虑用动物来源的RV制备疫苗。试验过的动物来源的RV疫苗有WC3(G6)株等。动物源性RV疫苗株虽然毒性较低,但不易激发机体产生针对HRV的中和抗体。这些疫苗株在欧美等发达国家中的现场试验效果令人满意,但在发展中国家效果不佳。究其原因可能是不同地区流行株的血清型不同及动物毒株有时不能激发异型保护。

3.2第2代RV疫苗(多价重组疫苗)

为提高疫苗的保护效率,研究者利用不同型别RV间的基因重配(或基因重排)构建了以动物或人的弱毒株为背景并能表达一种或多种HRV常见血清型抗原性相关蛋白的弱毒株疫苗,称为单价或多价重配疫苗。其中Midthun等人构建的恒河猴-人轮状病毒四价重配疫苗(RRV-TV)的效果较好,并先后在成人、大龄儿童和婴幼儿中对该疫苗进行了安全性和抗原性试验。结果表明,RRV-TV安全性好,保护率稳定,对重症腹泻效果较好,对普通腹泻的阻断效果也在70%左右。

3.3第3代RV疫苗(亚单位疫苗)

RV的天然亚单位疫苗是病毒空壳,是RV感染宿主细胞后产生的不含基因组RNA但含病毒的结构蛋白,形状类似RV的颗粒,用其免疫动物后可使受试动物得到良好保护。但大多数RV亚单位疫苗的研究是通过基因重组技术制备的RV抗原相关蛋白。如Oneal等人将VP2/6-VLPs、VP2/4/6-VLPs与霍乱毒素混合,再分别以口服和滴鼻方式免疫小鼠,结果后者所引发的抗体水平保护率都高于前者。该试验还表明,霍乱毒素作为佐剂能提高VLPs所引发的病毒特异性抗体滴度和保护率。因此,VLPs有可能成为非口服的RV候选疫苗。

3.4DNA疫苗和微囊化疫苗

DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。DNA疫苗的研究在国内外都有报道。Chen等人将微囊化技术应用到DNA疫苗研究中,以口服的方式用微囊化VP6DNA疫苗免疫小鼠,4周后小鼠血清抗体滴度升高,6周达到高峰,肠道sIgA明显升高,受同种RV攻击后大便排毒量明显减少,对小鼠显示出一定的保护性。微囊化DNA疫苗综合了DNA疫苗和微囊化疫苗的优点,为DNA疫苗的给药方式开创了一条新的途径。

3.5转基因植物口服疫苗

近20年来,人们通过对植物生理和基因表达调控的研究获得了操纵植物基因的能力,使植物成为外源蛋白的天然生物反应器之一。目前,转基因植物口服疫苗的研究已经取得了很大的进展。如费蕾等将鼠源A组RVVP7转到马铃薯中,通过PCR检测发现VP7基因已成功地整合到了马铃薯中,这为制备新型口服疫苗奠定了基础。植物的多种优越性均可被用于研究转基因疫苗,并且已经取得了很大的进展。但仍有一些障碍必须克服,如蛋白在植物中的表达水平低、表达产物在植物中的稳定性差、转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化等,科学家就这些问题进行了研究并正在加以解决。

4展望

疫苗研制的最佳构想应该包括安全、有效果、多价、成本低及保存和使用方便等,但要达到上述目标还需要一个漫长的过程,传统的疫苗存在一定的弊端。灭活疫苗和亚单位疫苗只能诱发体液免疫;减毒疫苗虽能诱发全面的免疫,但存在返毒的危险性;核酸疫苗兼具亚单位疫苗的安全性及减毒活疫苗的有效性,但核酸疫苗也存在整合到宿主染色体、致突变、产生抗菌素DNA抗体等危险性,其安全性还有待于进一步观察。总之,病毒疫苗的研究已经取得了一些可喜的进展,随着人们对病毒致病原认识的不断深入,研制的病毒疫苗也在不断完善。

摘自《黑龙江畜牧兽医》.-2008,(9).-17～18