DNA免疫制备猪传染性胃肠炎病毒S基因单克隆抗体和特性分析

猪传染性胃肠炎（Porcine transmissiblegastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV）引起的以腹泻、呕吐、脱水等为主要症状的高度接触性、消化道传染病。该病感染仔猪的致死率能达到100%，TGE的爆发和流行给养猪业带来巨大的经济损失。本研究将猪传染性胃肠炎病毒上带有A、B、C、D四个抗原位点的S基因克隆到真核表达载体PVAX中，构建的重组真核表达质粒PVAX-TGEV-S免疫BALB/c小鼠，在免疫后的42天，建立间接ELISA的检测方法，即：以TGEV全病毒包被ELISA板，5%的脱脂乳作为封闭剂，一抗、二抗的作用时间均为60min，检测到小鼠体内产生较高的抗体水平。因此，我们按照常规方法进行了细胞的融合。以TGEV上清液为筛选抗原，用建立的间接ELISA方法进行筛选，采用有限稀释法，经过三次克隆，最终获得两株杂交瘤细胞（分别命名为1H4，4E9）。两株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类都为IgM类，间接免疫荧光试验中，两株单抗均能与TGEV的上清液反应，能观察到细胞膜表面有特异性的亮绿色荧光，而在SP2/0对照组中，未见到有亮绿色荧光的产生。通过Western Blot实验，1H4单抗可以识别TGEV全病毒的S蛋白（220KD）的线性表位。以猪传染性胃肠炎（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）为抗原，分别与两株杂交瘤细胞上清液作用，经间接ELISA检测，结果表明两株单抗与TGEV有特异性反应，而与PRRSV、PEDV不存在交叉反应，说明获得的单抗有良好的特异性。以不同稀释度纯化的TGEV为抗原，应用Dot-ELISA方法检测了病毒与两株单抗的反应性，结果表明两株单抗都能与TGEV反应并出现深色的印记，最低检出率为0.005μg/点，而与SP2/0细胞上清没有反应性。同时，本实验利用蚀斑技术证明了1H4单抗在病毒中和活性实验中具有一定的中和病毒的活性，并且呈现一定的剂量依赖性。将单克隆抗体作为检测TGEV的试剂，用间接竞争ELISA方法检测病毒，根据间接ELISA的阴阳性判定标准，确定抑制率大于10.77%的情况下即为阳性。该检测方法与TGEV、PRV和PEDV无交叉反应，与RT-PCR检测病毒的方法相比其符合率为94.11%，并且多次重复性试验稳定性较好。间接竞争ELISA的建立不但在生产上提供了一种更简单、快速、灵敏及应用广泛的TGEV检测方法，而且为进一步建立更快、更直观、更简便的检测方法提供了依据。