某规模化猪场猪瘟和猪圆环病毒病2型混合感染的诊断

某规模化猪场猪瘟和猪圆环病毒病2型混合感染的诊断

刘建1，汤德元1，曾智勇1，罗险峰2，李春燕1，甘振磊1，郝飞1，王洪光1

1贵州大学动物科学学院；2贵州省动物疫病预防控制中心

近年来，许多研究发现规模化猪场猪病病毒病混合感染状况日趋严重，给猪病的防控和净化工作带来巨大挑战。2012年10月贵州省某规模化猪场送检80份血液样品及2头发病仔猪，为了确诊该规模化猪场疫病的感染状况，本实验在对该猪场送检的发病仔猪进行流行病学调查、临床症状观察、解剖病理诊断以及送检的80份血清采用ELISA方法进行血清学检测，初步诊断该猪场疑似猪瘟和猪圆环病毒2型混合感染，进一步采用RT-PCR和PCR技术进行核酸检测对送检病料确诊，结果表明该规模化猪场为猪瘟和猪圆环病毒病Ⅱ型混合感染。现将诊断结果报道如下：

1材料和方法

1.1材料

病料贵州省某规模化猪场送检的80份血液样品及2头发病仔猪。

1.2主要试剂

猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒、猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒（购自武汉科前动物生物制品有限责任公司）；鲜血琼脂培养基、普通肉汤培养基（购自上海阳光生物技术有限公司）；猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒、圆环病毒PCR检测试剂盒（购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）；琼脂糖（购自Biowest公司）；DL2000DNAMarker（购自TaKaRa公司）。

1.3检测方法

1.3.1流行病学调查

采用向养殖场主询问的方法，了解该猪场发病状况并记录。

1.3.2解剖病理观察

对该猪场送检的2头发病仔猪进行临床观察后处死，用高压灭菌的手术刀切开胸腔和腹腔，首先吸取积液或以棉签拭取胸膜及腹膜黏附物，然后观察病理变化，然后无菌条件下取出内脏，如心脏、肺脏、肝脏、淋巴结、肾脏和脾脏等，记录实验结果。

1.3.3细菌学检测

将上述无菌收集的病料进行直接触片，分别进行革兰氏和瑞氏染色，镜检。同时无菌操作将上述病料、关节积液和心血等划线接种在普通琼脂平板培养基和鲜血琼脂培养基上，37℃恒温培养24h～36h观察结果。

1.3.4ELISA检测

首先将送检血液样品放置于37℃恒温箱中1h，然后放置于4℃冰箱20min，在室温条件下4000r/min离心5min，收集上清液于EP管中，标记后按照ELISA抗体检测试剂盒说明书进行操作。

1.3.5RT-PCR和PCR检测

剖检上述送检发病仔猪取其淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏和扁桃体等病变组织20g，按病料与PBS液体积比1∶5加入PBS研磨制成悬液，然后分别按照猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒和圆环病毒PCR检测试剂盒说明书提取病毒总RNA和DNA。接下来进行猪瘟病毒RT-PCR和圆环病毒PCR检测。其中猪瘟病毒RT-PCR反应体系为：16.8μLRT-PCR反应液（用前混匀），1.2μL酶混合液，2μL模板RNA，总体积20μL；RT-PCR反应条件：42℃45min，95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃25s，35个循环；72℃延伸10min。圆环病毒PCR反应体系为：16μLRT-PCR反应液（用前混匀），2μL酶混合液，2μL模板RNA，总体积20μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果，并在凝胶成像系统中成像、拍照。

2结果

2.1发病情况

通过向畜主询问，该猪场已接种过猪瘟、猪口蹄疫和猪繁殖与呼吸综合征疫苗。目前，该规模化猪场共有仔猪120头，发病3天共计死亡12头。发病猪出现了生长发育不良，皮肤苍白，呼吸困难，身体皮肤发热，体温升高到40.0℃～41.0℃，稽留不退，衰弱颤抖，病猪先便秘，后腹泻，体温开始升高时可见病猪便秘，先排出干燥粪球呈颗粒状，后排出带白色黏液，黏膜或脓血的深褐色粪球等疑似猪瘟和猪圆环病毒感染的症状。

2.2临诊症状和病理解剖观察

送检病猪被毛粗乱，身体消瘦，皮肤苍白，尾根和肛门附近被粪便污染，精神不振，呼吸困难，发抖，间歇性痉挛，共济失调。剖检可见心包液增多、心肌柔软，肾脏、膀胱、脾脏、喉头、会厌软骨、胆囊、胃和大肠黏膜出血；脾脏明显肿大，边缘或尖端有出血性梗死灶；肝脏边缘钝厚、质硬、切面结构模糊；颌下、咽背、肠系膜及腹股沟等处淋巴结肿胀，切面呈均质苍白色；肾脏呈苍白色，有散在白色病灶，被摸易于剥落。

2.3细菌检测结果

将肝、肺、脾、肾、淋巴结等组织触片，进行革兰氏和瑞氏染色后，在光镜下未见有特征性的细菌生长，病料培养后也没有未观察到细菌生长，这表明该病例并非细菌感染所致。

2.4ELISA检测结果

在检测的80份血清样本中，CSFV阳性数为45份，阳性率为56.25%（45/80）；PCV2阳性数为42份，阳性率为52.5%（42/80）。虽然该规模化猪场免疫了猪瘟病毒疫苗，但是CSFV抗体阳性率仅为56.25%，很显然，该猪场CSFV的抗体合格率远未达到农业部《2012年国家动物疫病强制免疫计划》存栏猪抗体合格率≥70%的要求，这表明该猪场CSFV免疫效果较差，很有感染猪瘟病毒；由于该猪场并未免疫猪圆环病毒（Ⅱ型）疫苗，但是PCV2阳性率却高达52.5%，表明该猪场很可能感染了PCV2。

2.5CSFV和PCV2的PCR检测结果

提取发病仔猪病料中的病毒总RNA后，按照猪瘟RT-PCR检测试剂盒说明书进行扩增，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后出现了CSFV阳性条带，大小为272bp，与CSFV阳性对照条带一致，这说明送检的病料中存在CSFV，结果见图1。提取发病仔猪病料中的DNA后，按照圆环病毒PCR检测试剂盒说明书进行PCR检测，结果扩增出了PCV2阳性条带，大小为1154bp，与PCV2阳性对照条带一致，由此可知，送检的发病仔猪体内含有PCV2，结果见图2。

图1仔猪病科RT-PCR检测结果

图2仔猪病科PCR检测结果

3讨论与分析

流行病学调查结果表明，虽然该规模化猪场已注射了猪瘟疫苗，但是CSFV的抗体阳性率仅为56.25%，并未达到农业部《2012年国家动物疫病强制免疫计划》存栏猪抗体合格率≥70%的要求，分析原因可能为疫苗免疫失败所致，很多原因都会导致疫苗免疫失败现象的发生，如免疫程序不当、流行的疫病与免疫接种的疫苗血清型或亚型不相符、疫苗质量下降、免疫抑制等，其中免疫抑制是重要原因之一。通过对送检样品进行PCV2血清抗体水平的检测，结果显示该猪场PCV2抗体阳性率高达52.5%，由于该猪场并未免疫猪圆环病毒（Ⅱ型）疫苗，表明该猪场极有可能感染PCV2。根据血清学检测结果，同时结合临床症状调查，解剖病理观察，RT-PCR和PCR技术诊断，确诊送检病料为CSFV和PCV2感染。

研究表明，PCV2、PRRSV具有免疫抑制特性，感染了PCV2的猪体内淋巴器官中的T、B淋巴细胞数量减少，淋巴组织中巨噬细胞浸润，外周血和淋巴组织中的巨噬细胞单核细胞数量显著升高。因此，感染了PCV2后的猪群由于其免疫功能的下降，容易诱发多种病毒和（或）细菌的混合感染和继发感染，或者加重其他传染病的临床表现和病理过程，尤其与猪的其他传染病，如PR、CSF等混合感染时危害更加严重。

该规模化猪场发生的CSFV与PCV2混合感染，在很大程度上与PCV2造成的免疫抑制有关。因此，建议该规模化猪场及时对猪群补免猪瘟和猪圆环病毒（Ⅱ型）疫苗，并在猪群免疫后进行免疫抗体效价监测，以了解猪群免疫保护率及免疫效果，同时对猪群合理投喂抗生素以避免其他疫病的继发感染，从而控制疫病的蔓延。

近年来，猪病呈现多发和高发的特点，而且病原体的混合感染现象日趋严重，给养猪业带来了巨大的经济损失。

当前以猪瘟病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病病毒发生多重感染或继发感染对猪群的危害性最大，黄庭汝等对广东地区主要猪病流行病学调查结果表明猪场CSFV、PRRSV、PRV、PCV2混合感染现象比较普遍，而且主要以二重感染为主，三重、四重感染病例较少。因此，疾病发生后的快速准确诊断变得日趋迫切，ELISA方法和PCR技术在猪场疫病检测中的联合应用，不仅实现了血清学抗体检测，同时根据血清学抗体检测结果，再进行PCR检测，避免了对病原的盲目判断，从而实现对疫病感染状况的快速诊断。因此，本实验首先通过传统的方法对该规模化猪场送检病料进行了流行病学调查、临床症状观察和解剖病理诊断，然后结合ELISA方法和PCR技术对送检血清进行抗体检测以及对病料进行核酸检测，快速确诊了该猪场为猪瘟和猪圆环病毒病2型混合感染。