安徽省屠宰生猪圆环病毒2型感染情况调查

猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCv)属于圆环病毒科圆环病毒属，为单股负链环状DNA病毒，有两种基因型，即猪圆环病毒l型(PCVl)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCVl对猪无致病性。PCV2对猪的危害性极大，可引起猪圆环病毒病一系列相关的临诊病症，其中包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等；此外，还可以导致母猪繁殖障碍、增生性肠炎、坏死性间质性肺炎、猪呼吸道病综合征、仔猪先天性震颤等诸多疾病；同时，可侵害机体的免疫系统，导致免疫抑制，造成继发或并发其他传染病。因此，PCV2对养猪业造成的损失十分巨大，成为当今严重危害世界养猪业的重要病原之一。我国于2001年首次发现该病毒，目前PCV2感染在我国各地规模化猪场中已相当普遍，且呈上升趋势，安徽省养猪场的PCV2感染情况也不容乐观。本研究应用PCR技术对安徽省部分定点屠宰场外观健康的屠宰生猪样品进行PCV2检测，旨在了解PCV2在安徽省的感染和流行情况，为有效预防和控制PCV2感染提供科学依据。

1材料与方法

1．1试验材料

1．1．1被检样品2007年lo月至2008年4月采集安徽省合肥、宿州、阜阳、怀宁4个地区定点屠宰场l20头屠宰生猪的脾、肺、肾、腹股沟浅淋巴结，共计480份样品。

1．1．2参考毒株2株PCV2参考毒株和1株PCVl参考毒株，由安徽省兽医工作总站惠赠。

1．1．3引物根据PCV2BF株(AF381175)的基因序列，设计1对引物，由上海生物工程有限公司合成。该对引物可以扩增出630bp的基因片段。上游引物：5’-GGTRACACGGATATRGTAGTCC-3’；下游引物：5’-CGTI'ACCGCAGAAGAAGACAC-3’。

1．1．4试剂蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTP、MarkerDL2000均购自上海生物工程有限公司。其他化学试剂，如SDS、NaOH、EDTA,无水乙醇、氯仿、异丙醇等，为国产分析纯产品。

1．2试验方法

1．2．1被检样品处理将采集的屠宰生猪的不同组织器官剪碎、研磨，加入灭菌生理盐水配成1：4的混悬液，反复冻融3次后，6000r／min，离心3min，所得上清液分装于灭菌离心管中，-20℃保存备用。

1．2．2动物细胞总DNA提取取300μL样品上清液，加入等体积消化缓冲液及10μL蛋白酶K(20mg／ml)，55℃消化3h，12000r／min，离心l5min。上清液转移到新的l．5mL离心管中，加入等体积饱和酚，充分振荡，l2000r／min，离心15min。上层水相转移到新的离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比为25：24：1)混合物，混匀后，l2000r/min，离心l5min。上清液转移到新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，轻轻倒置混匀后，室温放置30min，12000r／min，离心5min。用70％的乙醇洗涤沉淀2次，l2000r／min，离心10min，弃上清液，37℃倒置风干。最后用含有RNase的TE溶解沉淀，-20℃保存备用。

1．2．3PCR扩增l)反应体系(50μl)：ddH2029μL、10xPCRbuffer5μL、MgCl2(20mg／mL)3μL、dNTP(25mmol／L)0.5μL、引物(20pmol／μL)各1μL、TaqDNA聚合酶(5U/μl)0．5μL、模板DNAl0μL。2)反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸l0min。

1．2．4扩增产物分析取5μLPCR产物直接进行1％琼脂糖凝胶(含0．5μg／mL溴化乙锭)电泳，凝胶成像仪上观察结果。

1．3统计分析

利用SAS9．0统计软件对PCV2阳性屠宰生猪不同器官检出率进行差异分析。

2结果

2．1安徽省4个地区定点屠宰生猪的PCV2检出率

应用PCR方法对合肥、宿州、阜阳、怀宁4个地区定点屠宰场屠宰生猪样品进行PCV2检测，其中怀宁屠宰场检出率为23．3％(7／30)、阜阳屠宰场为10％(3／30)、合肥和宿州屠宰场均为6．7％(2／30)，见表1。PCR扩增产物分析结果见图l一图4。

2．2安徽省定点屠宰生猪PCV2检出率与其他省份的比较

在安徽省4个地区定点屠宰场抽检的120头屠宰生猪中，检出PCV2,阳性的有l4头，检出率为11．7％，与其他8省的比较见表2。

2．3PCV2阳性屠宰生猪不同器官的检出率比较

应用PCR方法对安徽省4个地区定点屠宰场14头PCV2阳性屠宰生猪的脾、肺、肾、腹股沟浅淋巴结共计56份样品进行PCV2检测，其中脾和腹股沟浅淋巴结的检出率最高、达100％，肺的检出率略低、达78．6％，肾的检出率最低、为35．7％，见表3。脾、腹股沟浅淋巴结的PCV2检出率与肺差异显著，与肾差异极显著。

3讨论

(1)对安徽省4个地区定点屠宰场l20头屠宰生猪的脾、肺、肾、腹股沟浅淋巴结共计480份样品的检测结果表明，安徽省屠宰生猪中均存在一定程度的PCV2感染，且有的地方PCV2感染的现象较为严重。可能的原因推测为这些生猪已被PCV2感染，由于缺乏其他致病因子或应激等因素的协同作用，所以未引起发病或死亡。但这些外观健康的带毒猪是重要的传染源，可通过鼻液、粪便等废物排出病毒，PCV2对外界环境的抵抗力又极强，对猪群构成潜在的威胁。因此，加强养猪场的防疫监测工作，完善屠宰场的检验检疫措施，对于控制PCV2感染具有重要意义。

(2)对于PCV2感染的检测，目前临床上大多数采用ELISA检测抗体，ELISA具有可一次性大批量操作、成本低、检测结果稳定等优点，但由于ELISA不是直接针对抗原的检测，只能表明猪群感染过PCV2，并不能够完全反映猪体内的带毒情况；而PCR技术则是直接检测病毒基因，具有特异性高、简便快速、对标本纯度要求低等优点，在PCV2的流行病学调查中具有重要的应用价值。与其他8省的检测结果比较，安徽省定点屠宰生猪PCV2检出率虽然不高，但与采用同样方法(PCR)检测的广西省相比，检出率高出了4．6个百分点，故应引起安徽省相关部门的重视。

(3)对安徽省4个地区定点屠宰场l4头PCV2阳性屠宰生猪的脾、肺、肾、腹股沟浅淋巴结共计56份样品的检测以及生物统计分析结果进一步证明，PCV2主要感染部位是脾脏和淋巴结。因此，脾脏和淋巴结是检测PCV2的最佳组织器官。