抑制素免疫在家畜繁殖中的应用

1932年,McCullagh在牛睾丸水溶液提取物中发现了一种对FSH分泌具有反馈抑制作用的活性物质,命名为抑制素(inhibin,INH)。Robertson和Ling分别从牛和猪的卵泡液中分离出抑制素A和B,此后由于卵泡液中其它非甾体类激素的干扰,有关抑制素的研究进展缓慢。近年来,随着分子生物学的发展,抑制素的研究取得了突破性进展,人们对它的认识逐渐加深,国内外学者已在猪、牛、羊等家畜上证实了抑制素免疫对家畜生殖功能的重要调节作用,具有提高动物繁殖力的潜能,这在科研和生产上都具有重要意义。

1抑制素

抑制素是一种主要由睾丸的支持细胞和卵巢中的颗粒细胞分泌的,由α、β两个不同的亚基通过二硫键构成的二聚体糖蛋白质激素,是转化生长因子β(transforminggrowthfactorsβ,TGF-β)超家族成员。α亚基上有糖基化点,是INH的生物活性中心,β亚基有A、B两种形式,从而形成了抑制素的两收稿日期:2007210227第一作者简介:张成云(19822),男,河南淮阳人,在读硕士,现从事动物繁殖与免疫方面的研究。3通讯作者种类型,即INHA(αβA)和INHB(αβB)。抑制素在不同物种之间具有很高的同源性,如不同的哺乳动物抑制素α亚基的氨基酸同源性为80%,βA的同源性98%以上,βB也只有1～3个氨基酸的差异。此外,哺乳动物体内还存在一类完全由β亚基组成的二聚体则是抑制素的颉颃剂,称为活化素(ac2tivin,ACT),表现为对FSH分泌有促进作用,而分离的α和β亚单位均无生物活性。

抑制素的基本生物学作用是抑制FSH合成和分泌,从而影响动物精子发生,卵泡发育和排卵。抑制素是雄性动物初情期前生长发育的一种重要调节激素,与A型精原细胞的增殖和初情期前支持细胞的分裂有关,精液中INHB的存在及活性与精子密度呈正相关,抑制素分泌降低与雄性家畜不育关系密切。抑制素对卵泡发育有着重要的作用:一是参与优势卵泡的选择,调节卵泡的发育;二是影响排卵,且这种作用随着卵泡的逐渐成熟而增强,具有剂量依赖性,因此认为,INH可能是确定单胎和多胎动物种属特异性排卵的最重要的激素之一。此外,抑制素对雌二醇(E2)有负反馈调节作用,而生理剂量对黄体化激素(LH)分泌没有影响。

2抑制素免疫及其机制

抑制素免疫可分为主动免疫和被动免疫。目前用作免疫的免疫原主要有三种:第一种从性腺组织中提取的抑制素;第二种为化学合成的抑制素片断;第三种是利用基因重组技术,得到的抑制素融合蛋白。而随着生物技术的发展,利用抑制素基因构建核酸疫苗,注入动物体内,使得被免疫动物血液中长时期内有较高的抗体滴度,并持续较长时间,具有较好的应用前景。

抑制素主动免疫和被动免疫之所以能促进家畜排卵率和提高繁殖力,其机理是:抑制素对FSH分泌具有反馈抑制性作用,故可利用抑制素或其片断作为免疫原免疫家畜,所产生的抗体能中和内源性的抑制素,减弱了其对垂体负反馈作用,使FSH分泌增加,提高家畜的排卵率和产仔数;用抑制素抗血清被动免疫家畜,也能中和体内抑制素,使其FSH水平上升和排卵数增加。但有些试验与该理论不相符。有些学者认为抑制素或其亚单位可能具有旁分泌/自分泌功能,即抑制素免疫可能作用于卵巢,颉颃了抑制素的某些旁分泌/自分泌功能,从而提高了排卵率及精子生成的数量。

3抑制素免疫提高家畜的繁殖力

3.1抑制素免疫能提高母畜的排卵率用抑制素免疫母畜,所产生的抗体通过中和外周血浆中的抑制素,减弱其对垂体的负反馈作用,从而增加FSH分泌量,促进卵泡发育,增加大卵泡数,提高排卵率。也有报道指出,抑制素免疫同时增加了母畜在一个发情周期内卵泡波。

从性腺组织中提取的抑制素,能引发机体的免疫反应,产生的抗体能中和内源性的抑制素,因此常用抽提物处理绵羊和牛。进一步对抽提物分离、纯化后,能提高INH浓度和活性。来自卵巢的INH与人血清白蛋白偶合免疫家畜后,能显著提高免疫效果,增加排卵数。同样,加上佐剂制备成的抑制素的免疫原,具有较好的免疫效果。用抑制素抗血清被动免疫家畜,也能中和体内抑制素,使其FSH水平上升和排卵数增加。KazuakiSASAKI等(2006)用抑制素抗血清、疫苗分别被动和主动免疫山羊,卵泡数较对照组分别增加8.6倍(22.4/2.6)8.1倍(18.6/2.3),排卵率也显著提高,表明抑制素免疫能促进卵泡发育,提高排卵率。

化学合成的猪、牛、羊抑制素α亚单位氨基末端片断和载体蛋白偶联后免疫绵羊,可使羊的排卵数提高2～4倍,而单一的α亚单位片断免疫效果不好。应用基因重组技术生产的抑制素融合蛋白纯度高,免疫原性好,使受试动物排卵率比生化合成的片段免疫提高了3～5倍。MSMedan(2004)用油包被抑制素α制成的疫苗连续3次免疫肉牛,实验组的FSH、E2和P的浓度较对照组显著增加,大(≥10mm),中(≥7<10mm)和小(≥4<7mm)卵泡的数量都有所增加,排卵率较对照组增加了5倍,说明主动免疫能促进卵巢发育和增加排卵。利用抑制素基因构建的核酸疫苗,当与适当的蛋白质或多肽基因融合后,注入动物体内,使得被免疫动物血液中长时期内有较高的抗体滴度,具有较好的免疫效果。张德坤等(2005)用抑制素基因重组质粒免疫生产母羊,加强免疫后,免疫组的FSH水平显著高于对照组(P<0.05)。

用抑制素免疫后,家畜体内产生的抑制素抗体滴度与排卵数间存在正相关,并呈剂量依赖关系。ASatoshi等(2002)首次用抑制素α亚基主动免疫母牛,平均排卵数为4.4,再次为5.0,排卵率与血浆中FSH浓度和抗抑制素抗体滴度呈正相关,这主要是因为主动免疫减弱了抑制素对FSH分泌的影响。王杏龙等(2003)用重组绵羊抑制素α亚单位主动免疫40只经产波尔山羊,发现抑制素抗体滴度与直径大于4mm的卵泡数、排卵数和获取卵子或胚胎数存在显著的正相关(P<0.001),而抑制素抗体滴度与排卵率存在明显的负相关(P<0.001)。

3.2抑制素免疫可提高母畜的产仔数

张小东等(1998)用抑制素免疫3岁的考力代母羊,结果实验组的羊全部受胎并产羔,各组妊娠期无明显差异。王杏龙等人用(2003)重组绵羊抑制素α亚单位对40只经产波尔山羊处理,34只羊怀孕,29只分娩,平均产羔2.2(1～4)头。抑制素免疫也能提高黄牛的孪生率。桑润滋等(2000)用INH粗提物冻干粉和弗氏佐剂的乳化物免疫产后50d的荷斯坦母牛,结果发现INH主动免疫可以提高牛的超排效果,而且增加了胚胎数和可用胚胎数。杨利国等(2002)用猪精液抑制素主动免疫黄牛,妊娠期末,57头母牛中有15头牛产出双胎,孪生率达26.3%。ToshiroT用猪的抑制素α亚基N端1-26氨基酸片段主动免疫日本黑牛,黄体数、胚胎数以及可移植胚胎数显著高于对照组(P.0.05)。

通过抑制素基因免疫也能提高绵羊和黄牛的繁殖率。张德坤等(2004)应用抑制素基因免疫重组质粒(PCIS)免疫绵羊,首次免疫后第10d,免疫组的FSH水平有所上升,而在加强免疫第45d时免疫组的FSH水平显著高于对照组(P<0.05),免疫羊的双羔率达39.2%,显著高于对照组(P<0.05),比对照组提高29.2%。崔先利等(2006)用构建的抑制素真核融合表达质拉,提纯后辅以不同的免疫佐剂注入96头母黄牛体内,结果发现:抑制素质粒能促进双大卵泡发育(80.95%,68/84),诱发排双卵(60.71%,51/84),诱导黄牛孪生(41%,32/78)。

由于影响免疫的因素较多,故不同试验在排卵率和产仔数上存在差异。抑制素的免疫效果受免疫原性质、免疫剂量、免疫方法以及动物品种和个体差异等多种因素的影响。免疫佐剂、免疫增强因子对免疫效果也有影响。一般说来,使用的抑制素免疫原纯度越高、或是与抑制素氨基酸序列相似性越大,免疫后抗血清滴度越高,抗血清中和体内抑制素能力越强,FSH水平和排卵率的增加也越显著。关于抑制素基因免疫的文献不多,有关影响基因免疫和抑制素免疫的因素都可能影响抑制素基因免疫的效果,除免疫方法外免疫的途径、免疫佐剂、一些免疫因子包括免疫用质粒的结构对基因免疫都有影响。

此外,抑制素免疫有利于公畜的精子生成,使动物的性成熟提前。抑制素是雄性初情期前生长发育的一种重要调节激素,可望通过降低抑制素水平,促进更多精子生成来提高公羊的繁殖力。JHBame等(1999)使用牛抑制素α1-26gly-tyr和人α-球蛋白偶联后长期(60,90,104,124,270和395d)免疫6头荷斯坦公牛,其中4头牛射精量和血液中FSH浓度比对照组高近50%,射精量和FSH浓度呈正相关。用富含抑制素的卵泡液、人工合成的抑制素α亚单位肽段以或重组的抑制素α亚单位融合蛋白对羔羊免疫,可使羔羊的初情期提前。TO’Shea等(1993)用重组牛抑制素α亚基免疫3,7,l5周龄美利奴羔羊,免疫组的羔羊较对照组初情期提前了17d。